小鼠快、慢肌卫星细胞的分离培养及β肌动蛋白的表达

目的体外分离培养和纯化小鼠快、慢肌卫星细胞,观察细胞内β肌动蛋白(β-actin)的表达情况。方法采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法及差速贴壁法纯化ICR小鼠后肢骨骼肌腓肠肌(快肌)和比目鱼肌(慢肌)卫星细胞,免疫荧光抗体细胞化学染色法鉴定。取第2代快、慢肌卫星细胞提取总RNA,以GAPDH作为内参行RT-PCR,半定量分析快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量。结果体外分离及传代培养快、慢肌卫星细胞的快、慢肌肌浆蛋白表达阳性,细胞生长和增殖情况良好。快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量分别为3.71072和2.106028,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论小鼠快肌卫星细胞内β-actin表达高于慢肌,提示骨骼肌卫星细胞内β-actin表达可能与肌纤维类型有关。

连续3步缺口修复构建人β肌动蛋白-人凝血因子Ⅶ杂合基因座

目的:为了获得稳定高效表达凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞株,构建一个利用人β肌动蛋白(hACTB)基因座完整的上下游调控序列指导人凝血因子Ⅶ(hFⅦ)基因组序列在人胚胎肾细胞特异性高效表达的hACTB-hFⅦ杂合基因座。方法:采用3步连续缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂,构成能进行3次连续基因抓捕的载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术:第一步,从含hACTB基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆10 kb的hACTB基因3′端完整侧翼序列;第二步,从hFⅦBAC上亚克隆13 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAG)的hFⅦ基因组序列;第三步,从hACTB BAC上亚克隆20kb的hACTB基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成全长约50 kb的hACTB-hFⅦ杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座达到了原来hACTB基因座中hACTB基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ从起始密码子到终止密码子的基因组序列基因组序列精确置换的目的。结论:连续3步缺口修复构建杂合基因座细胞表达载体的技术,将为细胞高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。

人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:构建带GST标签的人β肌动蛋白(β-actin)基因的原核表达产物,纯化出GST-β-actin融合蛋白,为探究β-actin的各项生理功能做准备。方法:以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增β-actin基因,将其连接到带有GST标签的载体上,经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞,小量诱导表达后,利用GST-Sepha-rose 4B亲和珠纯化GST-β-actin融合蛋白,经SDS-PAGE和Western印迹检测。结果:目的基因经PCR技术得以扩增,将其与带GST标签的载体连接后再经双酶切鉴定及测序后确认构建成功;转化大肠杆菌Rossate感受态后获得小量诱导表达,纯化出GST-β-actin融合蛋白,并证实其有生物活性。结论:构建了人β-actin的原核表达载体,并获得了GST-β-actin融合蛋白。

合浦珠母贝β-肌动蛋白基因的克隆和序列分析

为进一步研究珍珠质基质蛋白外排机制,同时为今后合浦珠母贝(Pinctada fucata)不同组织的基因表达研究提供阳性对照,根据大鼠(Rattus norvegicus)胞质型肌动蛋白β-actin设计引物,通过RT-PCR方法克隆鉴定了合浦珠母贝肌动蛋白同源基因片段。序列分析表明,该片段编码的氨基酸序列与相应同源片段具有较高的保守性。合浦珠母贝β-肌动蛋白有多个特有的氨基酸残基。合浦珠母贝可能是在系统进化上较早分出的一支。

鳡β-肌动蛋白基因的克隆及表达分析

肌动蛋白(actin)在维持细胞结构、细胞运动和细胞分裂等过程中发挥着重要的作用.为了克隆鳡(Elopichthys bambusa)β-肌动蛋白(β-actin)全长cDNA,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,从鳡肌肉获得全长为1775bp的β-actin cDNA序列,其中包含1128bp的开放性阅读框,编码375个氨基酸,5′-非翻译(UTR)区为98个核苷酸,3′-UTR区为549个核苷酸.核苷酸与氨基酸的同源性分析发现,鳡β-actin与鲤形目类硬骨鱼的同源性均在98%以上,其中与团头鲂(Megalobrama amblycephala)的同源性最高,分别为98.94%和99.73%,而与其他脊椎类动物如哺乳类、鸟类、两栖类的同源性也分别在85%和97%以上,说明该基因在生物的分子进化过程中具有很高的保守性.采用核苷酸系统发育分析结果显示鳡β-actin与鲤形目类硬骨鱼聚类在一起,且与团头鲂的亲缘关系最近.RT-PCR分析结果显示,β-actin基因在鳡的肝脏、肾、肠、脑、心脏、鳃和肌肉等7个组织均有表达.

蛋白质印迹法中免染技术和总蛋白定量方法的研究进展

当含有蛋白质的SDS-PAGE胶浸泡在三氯乙酸或氯仿中时,经三氯化合物的作用,使得蛋白质中的色氨酸经紫外光照射会发出可见光,因而可在SDS-PAGE凝胶上实现对蛋白质条带的定位与定性。免染技术即是基于此原理而发明的。基于免染技术,我们可以检测到待测样品中的总蛋白条带的光密度,进而利用目的蛋白条带光密度与总蛋白条带光密度的比值对目的蛋白进行定量。本文就蛋白质印迹法技术中的免染技术和总蛋白定量方法的原理和优势进行简要综述。

根据mRNA稳定性推断死亡时间的研究

目的检测大鼠肺、胸肌β肌动蛋白(β-actin)mRNA在死后不同时间的表达,为死亡时间的推断寻找新的指标。方法大鼠断颈处死后于21℃温度控制系统模拟死后改变,在不同时间点抽提相应组织总RNA,利用RT-PCR技术检测β-actinmRNA的表达水平变化并对扩增产物进行半定量分析。结果大鼠肺β-actinmRNA于死后12d仍可检出,胸肌在死后8d的检测呈阴性。β-actinmRNA在肺脏和胸肌的稳定性呈现器官差异性和时间差异性。结论观察死后肺、胸肌β-actinmRNA的变化,可为死亡时间推断提供客观依据。

改进的一步法提取昆虫总RNA(英文)

用修改了的异硫氰酸胍法从两种森林昆虫Clostera an-astomosis和Saperda populnea的不同组织中快速提取总RNA。电泳检测和cDNA合成分析结果表明,RNA未降解。经紫外分光光度计检测,A260/A280在1.8到2.0之间,表明RNA的纯度很高。用RT-PCR合成的双链cDNA的长度大于2kb,表明mRNA的完整性。用PCR的方法克隆了C.anasto-mosisβ肌动蛋白和几丁质酶的基因片段,表明RNA可用于其它分子操作。使用这个方法,在4个小时内可至少从8个样品中提取RNA并进行电泳分析。这些结果表明用这个修改后的一步法提取昆虫总RNA是省时,省钱和有效的。图3参10。

人脂肪细胞总RNA的抽提及对脂联素mRNA的扩增

目的建立一种提取脂肪组织总RNA并能够有效地进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法。方法利用Trizol试剂提取人皮下脂肪组织总RNA,用紫外分光光度法鉴定其产率及纯度,用琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR鉴定所提取的总RNA的完整性。结果采用选择性mRNART-PCR试剂盒特异性地扩增出脂联素(adiponectin)和β肌动蛋白(β-actin)的mRNA。结论在脂肪组织总RNA抽提中容易混入基因组DNA,而采用选择性mRNART-PCR只针对mRNA进行特异的扩增。

大鼠CCl_4所致肝纤维化自发逆转的基因表达谱研究

目的:利用cDNA微阵列杂交筛选肝纤维化自发逆转过程中的差异表达基因,从而揭示纤维化逆转的基因表达谱. 方法:通过四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)注射SD大鼠8 wk,随后停药6 wk建立肝纤维化自发逆转的动物模型.提取纤维化逆转过程中不同时间段的肝组织mRNA,与cDNA微阵列杂交,筛选表达水平明显上调或下调的差异基因,并结合Cluster分析等进行分类.此外选择α共核蛋白、A-raf、早老素2及β肌动蛋白作RT-PCR以验证检测结果. 结果:CCl4诱导的肝纤维化在停止毒剂注射后出现进行性消退.cDNA微阵列杂交证实,肝纤维化消退过程中共有254条基因出现转录水平改变,占基因总数的21.59%. 其中8,10,12,14 wk的差异表达基因分别为54, 85,97,132条.筛选所得的肝纤维化逆转相关基因主要涉及代谢相关酶、脂肪代谢相关蛋白、离子通道、转录因子、胃肠激素及受体、MAPK及PI3k/Akt信号转导通路等.RT-PCR检测与cDNA微阵列杂交一致,证实了结果的可靠性. 结论:肝纤维化逆转过程中基因表达谱发生显著改变, 主要涉及代谢相关酶、转运蛋白/协同转运蛋白、胃肠激素及受体、脂蛋白/脂肪酸结合蛋白、转录因子/ 核因子、MAPK信号转导通路等6类基因.

巨细胞病毒启动子序列检测的复合实时定量PCR方法的建立

目的：建立和验证用于巨细胞病毒（CMV）启动子序列检测的复合实时定量 PCR 方法。方法以 CMV 启动子序列和小鼠管家基因β肌动蛋白基因的 cDNA 序列为模板分别设计探针和引物，用 SYBR GreenⅠ熔解曲线分析引物扩增的特异性。对反应体系进行系统优化，并验证方法的灵敏度、线性和重复性。结果针对 CMV 启动子序列的上游引物为5′AGACTTGGAAATCCCCGTGAGT3′，下游引物为5′CG-TATTAGTCATCGCTATTACCATGGT3′，探针为5′AACCGCTATCCACGCCCATTGATG3′。针对β肌动蛋白基因的上游引物为5′CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC3′，下游引物为5′TAGAGGTCTTTACGGATGT-CAACGT3′，探针为5′TCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGC3′。用 CMV 启动子标准品制作的标准曲线，反应效率为100％，相关系数为0．9978，定量范围达到1．5＆#215;102～1．5＆#215;107拷贝，反应体系灵敏度为30拷贝。结论建立了检测 CMV 启动子序列的复合实时定量 PCR 方法。

巨细胞病毒感染的细胞微丝骨架重组异常

本研究探讨巨细胞病毒(CMV)感染对人胚成纤维细胞(HF)微丝骨架影响及与病毒复制状态的可能关系。用显微镜观察细胞形态,采用RT-PCR检测β-actin表达,Western-blot检测胞内肌动蛋白质含量,间接免疫荧光标记病毒即刻早期抗原(IE)与微丝骨架探针观察HF细胞内感染状况及微丝骨架变化。结果表明CMV感染率大于95%,IE抗原主要位于胞核。受染细胞变粗、变圆,甚至脱壁,呈时间依赖性。感染后72、96小时,受染细胞内β-actin表达呈渐进性下调,差异显著(P<0.05);96小时后胞内β-actin含量则为未感染组的(74.2±13.4)%,差异显著(P<0.05)。受染细胞内微丝排列紊乱,极性消失;细胞融合,荧光强度明显减弱。结论CMV引起细胞内肌动蛋白质、微丝骨架形态及重组异常可能有助于其侵袭宿主细胞并进一步活化及复制。

竞争RT-PCR法定量检测多药耐药基因的表达

MDR1基因的表达量与肿瘤细胞的耐药性呈正相关且在多种肿瘤组织中都有过度表达。准确监测肿瘤病人MDR1基因表达情况对选择化疗方案和提高化疗效果有重要作用。在检测MDR1基因表达的方法中RT-PCR检测MDR1的过程中一般使用β肌动蛋白作为外参照,通过计算MDR1 cDNA与β肌动蛋白cDNA的比值来表示MDR1基因的表达量。这样只能得到MDR1基因相对β肌动蛋白基因的表达量,而不能测出其绝对表达量。

早产儿严重并发症分析及相关诱发因素研究

早产儿是临床上胎龄低于37孕周的新生儿,约占分娩总数的5%～15%。早产儿由于孕周较短,胎儿的各个器官发育不成熟,出生时体质量低、预后差,并且容易发生各种并发症。

CAG和MLP启动子控制的重组禽腺病毒构建

根据鸡胚致死孤儿病毒(CELOV)的序列设计引物,通过PCR方法扩增了禽腺病毒FAVI-JS株的晚期启动子(MLP),序列与CELOV的MLP同源性为99%。分别构建了MLP和商品化启动子CAG控制的表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的禽腺病毒转移载体。通过载体与禽腺病毒FAVI-JS株在原代鸡胚肾细胞内进行同源重组,分别获得了MLP和CAG控制的表达eGFP的重组禽腺病毒,为探讨不同启动子对禽腺病毒活载体疫苗免疫效果的影响提供了条件。

荧光多重PCR对α地中海贫血的基因诊断

目的 :建立一种快速、灵敏的α地中海贫血诊断方法。方法 :应用荧光引物对正常人和患者进行多重PCR ,同时扩增α1和α2 珠蛋白基因和内对照β肌动蛋白 ( β actin) ,用PerkinElmerABIPRISMTM3 77DNASequencer自动分析结果 ,并对所得数据进行统计。用连锁分析的方法PCR扩增同一批模板α2 珠蛋白基因上游的 (CA) n,跑变性胶并将结果与前一种方法对照。结果 :荧光多重PCR自动分析和扩增 (CA) n 连锁分析得出的结论与实际情况完全相符 ,结果判断容易。结论 :荧光多重PCR法灵敏、简便 ,单管内就能完成 ,适合运用于α地中海贫血的快速诊断 ,并有可能运用于移植前诊断和母体外周血分离胎儿有核红细胞产前诊断。