β萘黄酮对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因表达的影响

目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮（β-NF）对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（GCLC）基因转录的影响，研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ—GCS）基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC—PGL3-enhancer—Luciferase报道载体（GCLC—Luc）转染大鼠支气管上皮细胞（RTE）和肝癌细胞（H4ⅡE），分DMSO空白对照组和不同浓度的各刺激因子组，比较各组荧光素酶值的差异以筛选影响GCLC基因转录调控的刺激因子，并比较筛选到的刺激因子β—NF对GCLC—Luc在RTE和H4ⅡE细胞内表达影响的异同。2种转染后的细胞均分为β—NF实验组（10μmol／L）和DMSO空白对照组，以荧光定量PCR检测各组的细胞内源性γ—GCS转录水平变化。分别将构建的r系列缺失报道载体、GCLC—Luc和激活蛋白1（AP-1）、NF—κB定点突变报道载体转染2种细胞，分β-NF实验组（10μmol／L）与DMSO空白对照组，比较各组荧光素酶值的变化，分析B—NF作用的调节位点和转录调控作用相关元件。结果1、10、100μmol／L的β—NF均强烈抑制RTE中GCLC基因表达，荧光素酶值显著低于DMSO空白对照组（161354-1456、27524-218、15794-294比259714-1662，均P〈0．01）。在H4ⅡE中，1、10、100μmol／L的B—NF则促进其表达，荧光素酶值显著高于DMSO空白对照组（5686±441、13601±746、13978±164比3645±367，均P〈0．01）。荧光定量PCR显示10μmol／L的β-NF作用下，RTE内源性γ—GCS的mRNA表达水平是DMSO空白对照组的0．73倍，在H4ⅡE细胞中则是1．98倍。GCLC—Luc、r系列缺失报道载体转染2种细胞后，RTE中各载体β—NF实验组荧光素酶值均低于DMSO空白对照组（P〈0．01），而H4ⅡE中则高于DMSO空白对照组（P〈0．05）。β-NF作用的调节位点定位于转录起始位点上游-390～＋2bp范嗣内。用针对该区域的AP-1、NF-κB定点突变报道载体转染细胞后，转染GCLC—Lue载体的B—NF实验组RTE荧光素酶值较DMSO空白对照组下降（91．50±0．32）％，与之相比，转染AP-1、NF-κB定点突变报道载体的细胞下降幅度并没有减少（P〉0．05）。在H4ⅡE，β—NF作用下转染GCLC—Lue载体的细胞荧光素酶值上升幅度则高于转染AP-1定点突变报道载体的细胞[（3．81±0．19）倍比（2．08±0．19）倍，P〈0．05]，而与转染NF—κB定点突变报道载体的细胞荧光素酶值上升幅度[（4．41±1．01）倍]相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论在大鼠RTE和H4ⅡE，β—NF影响GCLC基因的表达具有细胞特异性。在大鼠H4ⅡE，β—NF通过激活抗氧化应答元件（ARE）类似的AP-1调控GCLC基因表达。