牙鲆T细胞抗原受体(TCR)β链同源cDNA的克隆

从牙鲆外周血淋巴细胞cDNA文库中克隆TCRβ1319bp同源cDNA序列并对其基因结构进行生物信息学分析。RT-PCR其编码区为942bp,编码314个氨基酸,编码区包括V、D、J和C区4个基因片段。TCRVβ片段主要包括从21～115位氨基酸残基的95个氨基酸序列,Jβ区与哺乳动物的Jβ区高度保守,在位于Vβ和Jβ之间的Dβ区中没有发现8碱基保守序列(GGACAGGG),CDR3β氨基酸序列为GTRILYE。牙鲆TCRCβ片段共有179个氨基酸残基,缺失位于Cβ细胞外区和临近区域的2个5～9氨基酸弹性区域。牙鲆TCRCβ片段的铰链区有6个氨基酸残基,缺少半胱氨酸位点,含Lys271保守位点。经RT-PCR检测,在脾、外周血和前肾中都发现TCRβ的表达,肌肉和肝中均未克隆到目的片段。

多发性硬化患者外周血T淋巴细胞受体β链可变区多态性研究

目的探讨多发性硬化(MS)不同阶段外周血T淋巴细胞受体β链可变区(TCRVβ)多态性的特点。方法收集首都医科大学宣武医院神经内科临床孤立综合征(CIS)患者30例、复发-缓解型多发性硬化(RRMS)患者40例、继发-进展型多发性硬化(SPMS)患者10例、健康对照者30名,经TCRVβ单克隆抗体标记后采用流式细胞仪分析各组外周血TCRVβ扩增程度以及TCRVβ24个亚家族扩增患者百分比、扩增片段所占百分比的差异。结果 CIS、RRMS及SPMS组TCRVβ存在扩增患者比例、扩增个数和扩增分数均高于对照组(P<0.01),而CIS、RRMS及SPMS组间比较无统计学差异(P>0.05)。CIS、RRMS及SPMS组CD4+TCRVβ2扩增频率均高于对照组(P<0.008),CIS组、RRMS及SPMS组CD8+TCRVβ11表达水平均低于对照组(P<0.05),SPMS组CD4+TCRVβ21.3表达水平低于CIS组(P<0.05)。ROC曲线分析提示CD8+TCRVβ11的扩增片段所占百分比对MS诊断具有一定价值,对MS分型无诊断价值;CD4+TCRVβ21.3的扩增片段所占百分比对SPMS诊断具有一定价值。结论可通过检测部分TCRVβ片段对MS及SPMS的早期诊断提供相关依据。

成人急性T淋巴细胞白血病T淋巴细胞受体β链基因重排的特点及其在微小残留病定量检测中的意义

目的 建立以TCR β基因重排为分子标志,基于ASO引物的RQ-PCR方法,检测成人T-ALL患者的TCR β基因重排,以利于动态监测患者的MRD.方法 20例成人T-ALL患者的初诊DNA标本经多重PCR检测方法设计38条引物,分成3管,分别扩增TCR β基因完全重排和不完全重排,克隆产物经电泳和双色基因扫描鉴定.对其中4例患者进行基因测序和序列比对分析,根据克隆特异性序列信息,利用软件设计4条ASO引物,作为RQ-PCR检测的上游引物,合成通用的Jβ下游引物和TaqMan探针,对患者的随访标本定量监测MRD.结果 20例患者中有17例可检测到克隆性TCR β基因重排,克隆检出率为85.0%（17/20）.其中16例可检测到至少1个Vβ-Jβ完全重排（94.1%,16/17）,7例患者有Dβ-Jβ的不完全重排（41.2%,7/17）,完全Vβ-Jβ和不完全Dβ-Jβ重排之间的比例约为2∶1.双色基因扫描分析显示Jβ2家族的使用频率为73%,Jβ1家族的使用频率为27%,Jβ2家族的使用频率明显高于Jβ1家族.4例患者使用ASO引物RQ-PCR扩增TCR β重排靶基因的标准曲线的斜率为-3.60～-3.27,相关系数＞0.99,敏感性达4×10-5μg/μl,荧光背景信号不显示或较低.监测4例T-ALL患者在疾病治疗各随访时间点的TCR β重排靶基因水平,包括诱导完全缓解、巩固治疗等时间点,RQ-PCR显示其MRD水平随病情的缓解呈逐渐下降的趋势.结论 以克隆性TCR β基因重排为靶分子的特异性寡核苷酸引物RQ-PCR方法可对T淋巴细胞系统的恶性克隆进行准确定量,适用于成人T-ALL患者MRD的随访监测.

儿童急性T淋巴细胞性白血病T细胞受体β链基因重排的特点及其在微小残留病定量检测中的意义

目的建立以T细胞受体β链（TCRβ）基因重排为分子标志定量检测儿童急性T淋巴细胞性白血病（T—ALL）微小残留病（MRD）的实时定量聚合酶链反应（RQ—PCR）检测体系。方法应用BIOMED-2欧洲协作组设计的PCR检测体系，检测26例初发T—ALL患儿的TCRβ基因重排，并进行序列分析与比对。对其中6例患儿根据基因重排后连接区序列设计等位基因特异性寡核苷酸（ASO）引物，结合胚系TaqMan探针与引物，建立RQ—PCR检测方法，行缓解期标本MRD定量追踪检测。结果92．3％的T—ALL患儿可检测到克隆性TCRβ基因重排[84．6％具有Vβ-（Dβ）-Jβ完全重排，50％具有Dβ-Jβ不完全重排]。通过序列分析，V片段使用频率最高的家族为BV5、BV6，J区使用频率最高的家族为Jβ2．7，J1．3、J2．4、J2．6未被使用。6例患儿ASO标准曲线的斜率为-3．54-3．37，截距为19．35-20．51，相关系数〉0．98。定量范围均达到10^-4。对随访期标本MRD检测发现，复发患儿的MRD水平在复发前显著升高。结论以TCRβ基因重排为分子标志对T—ALL患儿行MRD定量检测，具有较高的敏感度和特异性，动态追踪检测随访期标本MRD水平具有重要的临床价值。

实验性变态反应性神经炎T细胞受体Vβ基因的表达和特征

目的 探讨在实验性变态反应性神经炎 (EAN)中特异性识别抗原并呈优势扩增的为哪些Vβ亚家族基因。 方法 应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、原位杂交技术 ,比较T细胞受体(TCR)Vβ2、6、8、10、14基因mRNA在EAN组和对照组大鼠外周血、淋巴结及周围神经组织中的表达水平。结果 (1)TCRVβ6、8基因mRNA在EAN大鼠淋巴结中的表达 (个 HP ,下同 )早期即有升高 (分别为 41 1± 1 1和 74 4± 1 9,对照组为 2 5 9± 1 5和 2 6 1± 1 6 ) ,至发病高峰期更加明显 ,恢复期则与对照组无显著差异。 (2 )EAN组大鼠周围神经浸润T淋巴细胞的TCRVβ 6、8基因mRNA的表达从潜伏期 (分别为 4 9± 2 9和 11 7± 9 1)至发病高峰期 (分别为 18 8± 5 8和 36 5± 6 3)逐步增加 ,恢复期又有所下降 ,差异有极显著意义。 (3)EAN大鼠发病早期及高峰期淋巴结与周围神经浸润淋巴细胞中TCRVβ 8基因mRNA的表达高于TCRVβ 6基因 ,差异有极显著意义。 结论 T细胞上识别和限制EAN发病的特异性抗原的TCRVβ基因亚家族为TCRVβ 6和Vβ 8,以Vβ 8为主 ;特异性表达TCRVβ 6、8基因的T淋巴细胞在淋巴结中被激活并克隆性扩增 ,继而迁移至病变的周围神经组织中 ,可能导致一系列的免疫损害。