γ-环状糊精生产用菌的筛选及初步鉴定

通过对新疆吐鲁番葡萄沟的土壤中所筛选到的一株芽孢杆菌 3 2 - 3 - 1 0进行研究 ,认为其环状糊精葡萄糖基转移酶 (cyclodextrin glucosyltransferase,CGT酶 )作用于马铃薯淀粉后 ,生成的环状糊精产物主要为 γ-环状糊精 (γ- cyclodextrin,简称 γ- CD) ,可以作为工业生产 γ- CGTase的出发菌株。

γ-环状糊精葡萄糖基转移酶产生菌32-3-10产酶条件及酶促反应条件的研究

筛选到一株芽胞杆菌 32 - 3- 10 ,它所产γ -环状糊精葡萄糖基转移酶可以淀粉为底物生成γ -环状糊精 ,对其产酶条件及酶促反应条件进行了研究。

β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵染菌的分离和16srDNA分析

目的:解决β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵生产过程中频繁出现的不明原因的酶活降低问题。方法:我们采用特异性酚酞筛选培养基对发酵异常的发酵液进行菌种分离,对分离得到的菌株进行16 srDNA基因序列分析,同时研究他们的发酵过程中光密度、酸碱度、酶活指标。结果:分离得到了一株可以在碱性条件下与正常生产菌共生的芽孢杆菌。经过对发酵过程进行研究,在不同的发酵时期中该菌的光密度的变化和正常生产菌有明显差异,最终酶活仅为正常菌的1/6。通过对16 srDNA基因序列进行分析,确定其为芽孢杆菌,和正常生产菌基因相似度达到93.81%。结论:在生产中采用16 srDNA基因序列分析,可以排除染杂的的生产菌种。只要严格控制发酵出发菌株和严格保证发酵环境的纯培养条件,可以防止染菌的发生。

发酵生产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的气球菌(Aerococcus sp·P3-2)污染及防治

我们从环状糊精生产厂家的β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵失败的发酵液中分离出一株气球菌。此菌可以在发酵专用碱性培养基上生长,但不生产β-环状糊精葡萄糖基转移酶。通过研究该菌种在碱性培养基上的发酵过程中的pH、OD、酶活,同时使用16SrDNA进行分析,证明此菌种为气球菌(Aerococcussp.P3-2),其在发酵过程中可以明显降低发酵培养基的pH,对正常生产菌形成抑制。通过对发酵生产可能染菌的环节进行微生物取样分析,该菌种大量存在于空气过滤系统的积水中,从而找到污染源,由此判断是由于空气净化系统被污染所导致的发酵失败。在实际生产中定期对空气净化系统中的积水进行排放处理,同时对发酵过程中的酶活和pH进行监控,可以做到发酵污染的早发现直至杜绝发酵污染。

响应面分析法优化α-环糊精的酶转化工艺

为获得较高的α-环糊精转化产率,采用单因素实验和响应面实验方法,筛选底物种类、底物浓度、加酶量、酶作用时间、作用温度和pH等多个单因素,对海洋芽孢杆菌Y112产的α-环糊精葡萄糖基转移酶产α-环糊精的条件进行了优化。然后利用Plackett-Burman实验筛选得到影响α-环糊精转化率的3个主要因素:底物浓度、温度和pH值。最终采用响应面分析法得到的最佳转化条件为马铃薯淀粉浓度为5%,加酶量200 U/g(淀粉),pH值为8.4,温度30℃,200 r/min反应6 h,α-环糊精转化率均值为28.67%,比优化前的产率提高了2.48倍。

产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质

利用环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）快速筛选法从枝江酒业的酵泥中筛选获得11株CGTase产生菌。用酚酞法测定所得11株菌株的酶活,最终得到β-CGTase酶活最高的一株菌株,命名为Hhj-1。通过对菌株的形态观察以及16S rDNA测定,并建立该菌株的系统发育树,确定该菌株属于坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）。对该菌所产的β-CGTase粗酶液酶学性质进行研究,结果表明,该酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH为7.5。在35~45℃保温1 h相对酶活仍可保持在90%以上,且该酶在pH 5.0~10.0的较宽范围内都较稳定,说明其对pH适应范围较广,因此应用有较大的灵活性。

β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达及酶学性质

获取来自坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)的编码β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltransferase,β-CGTase)的基因cgt,并将带有His-Tag去除信号肽的cgt基因克隆到表达载体p ET28a(+)后,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过热变性和Ni-NTA获得重组β-CGTase纯化酶,再通过SDSPAGE检测,蛋白分子量在74 k Da左右,并初步研究了重组β-CGTase的酶学性质。结果表明:重组β-CGTase的酶促反应的最适p H为7.0,并且在p H为5.5~10.0范围稳定,最适反应温度为为65℃,重组酶在55℃保温5 h时仍保持90%以上的活性。研究一些金属离子和化学试剂对重组酶的影响发现β-CGTase是一种金属酶,Ca^(2+)对酶的催化起关键作用,尤其是在低浓度下对酶的活性有促进作用。对重组酶的酶促反应动力学研究得出Km为3.75 mg/m L,Vmax为0.33 mg/(min·m L)。该研究成功实现了β-CGTase基因的异源表达,为进一步实现β-CGTase的工业化生产和应用奠定了基础。

来源于Paenibacillus campinasensis SK13.001的β-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达和反应条件优化

以1株来源于Paenibacillus campinasensisSK13. 001的基因组为模板,通过PCR扩增获得编码β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltransferase,β-CGTase)的基因。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中,转化Escherichia coliBL21(DE3),经过摇瓶发酵,得到该酶的环化活力为15 U/mL;通过单因素实验对该酶转化淀粉生产环糊精的反应条件进行优化。结果表明,当底物为质量浓度30 g/L的玉米淀粉,反应液pH值为7. 0的磷酸盐缓冲液,温度55℃,加酶量5 U/g干淀粉,反应时间8 h,环糊精的转化率达到45. 63%,3种环糊精的质量比为α∶β∶γ=7∶75∶18。通过对该酶反应的工艺条件进行优化,为环糊精的工业化生产提供参考。

Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶Leu277突变提高α-环糊精产量

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)能够以淀粉为底物发生环化反应生成环糊精,包括α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)、β-环糊精及γ-环糊精,其中α-环糊精产量低且易降解。该研究选择Bacillus stearothermophilus NO2来源的CGTase,考察其突变体E142P、L277M、L277F、E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A以可溶性淀粉为底物生产α-CD的能力。与野生型相比,最优突变体为E142P/L277M,α-环糊精产量提高1.7 g/L,且在产物中占比提高14.3%。分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟结果表明,E142P/L277M突变体中2个突变位点相互影响较小。此外,L277M/N353A催化效果较差,MD结果表明该突变体整体结构变化较大且溶剂可及表面积增大,不利于转糖苷反应的发生。该研究为CGTase的分子改造提高环化反应活性以及CGTase在α-环糊精工业化生产中提升产量提供了新思路。

复合诱变选育高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株及产酶条件优化

对出发菌株Paenibacillus macerans TLLY7进行紫外-微波复合诱变,以获得高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株,并用响应面法优化复合诱变菌株的发酵条件来提高酶活力。确定了紫外、微波诱变的最佳条件:20 W紫外灯照射70 s,微波低火档辐照60 s。筛选出复合诱变菌株UM2-6,经过8次连续传代培养,验证其遗传性能较稳定,菌株酶活力可达3.09 U/mL,是出发菌株酶活力(1.35 U/mL)的2.29倍。在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman试验筛选出影响发酵的3个显著性因素:培养温度、初始pH、接种量,设计Box-Behnken中心组合试验确定菌株最优发酵条件。结果表明,最佳发酵培养基成分为可溶性淀粉10 g/L、酵母浸粉10 g/L、NaCl_(2)g/L、CaCl_(2)0.2 g/L、K_(2)HPO 4·3H_(2)O 1 g/L,最佳发酵条件为培养温度37.1℃、初始pH 6.9、接种量4%,此时突变菌株UM2-6产α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活力为4.19 U/mL,为优化之前酶活力(3.09 U/mL)的1.36倍。该研究为进一步工业化开发利用性状稳定且高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株提供了借鉴。

钙离子协同溶氧提高重组β-CGT酶的可溶性表达量

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,简称CGT酶)能够通过环化反应生成环糊精,但天然菌株发酵产酶的水平较低,使得环糊精的生产成本居高不下,因此旨在通过异源表达以及发酵优化策略来提高CGT酶的表达量。首先将来源于Bacillus xiaoxiensis STB08的cgt基因插入质粒pET-20b(+)中,在宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行分泌表达,在适宜的培养基中发酵96 h后,胞外酶活为34.66 U/mL。然后对发酵条件进行优化,改变溶氧以及添加一定终浓度的Ca^(2+)可使酶活提高到66.86 U/mL及83.15 U/mL,且溶氧与Ca^(2+)协同作用可使酶活提高到105.69 U/mL,相比于优化发酵条件之前提高了204.93%。最后通过蛋白质定位分析及流式细胞分析对溶氧及添加Ca^(2+)影响发酵水平的机理进行了研究。结果表明,较低的溶氧能够减少重组大肠杆菌包涵体的形成,且溶氧较低时细胞活性较高,但溶氧过低时菌体浓度太低,不能满足菌体正常生长及代谢的需求。而添加Ca^(2+)能够减少包涵体的形成,同时Ca^(2+)对细胞有较好的保护作用,因此,在溶氧以及Ca^(2+)的协同作用下,能够保证菌体的高生长浓度,且Ca^(2+)能够增加细胞透性并保护细胞,使得活细胞数目显著增多。该研究提高了CGT酶在大肠杆菌中的可溶性表达量,为该酶的工业化生产提供了新的策略及方法,也可为相关酶的发酵优化提供参考。

环糊精葡萄糖基转移酶合成AA-2G反应条件初探

为了探究重组菌株pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)催化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)的效果,用LB发酵培养基表达重组蛋白CGTase-T1,经亲和纯化柱纯化并浓缩后,测定其β-环化活性和歧化活性。以维生素C(Vitamin C,V_(C))和β-环糊精为底物,酶法合成AA-2G,并通过单因素优化实验,进一步探究了不同糖基供体、底物浓度、pH、温度、底物比例、蛋白浓度以及反应时间对AA-2G产量的影响,对酶合成AA-2G的动力学进行了分析。结果表明:此酶具有合成AA-2G的能力,未优化前AA-2G的产量为0.67 g/L。优化后,考虑到低成本和经济效益,选择可溶性淀粉和麦芽糊精为糖基供体,当糖基供体为可溶性淀粉时,底物浓度为70 g/L,反应pH4.5,反应温度37℃,底物比例3/3(VC/糖基供体),蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为42 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到12.68 g/L;当糖基供体为麦芽糊精时,底物浓度为30 g/L,反应pH5.0,反应温度37℃,底物比例4/2,蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为30 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到4.96 g/L。在最适条件下,AA-2G的产量分别是未优化反应条件下的18.93倍和7.40倍。经动力学分析发现可溶性淀粉作为糖基供体的催化效率高于麦芽糊精,因此,可溶性淀粉作为糖基供体比麦芽糊精更具有优势,合成得到AA-2G的产量更高。本研究成功将重组CGTase-T1用于AA-2G的合成,通过优化酶法合成的反应条件,使AA-2G的产量得到了大幅提高,为实现AA-2G的工业生产提供参考意义。

Molecular modification of Bacillus stearothermophilus NO_(2) cyclodextrin glucosyltransferase and preparation of α-cyclodextrin

Cyclodextrin(CD)is produced by the catalysis of starch or starch derivatives by cyclodextrin glucosyltransferase(CGTase),and its yield is mainly limited by the product and reaction specificity of CGTase.In this study,we use CGTase derived from Bacillus stearothermophilus NO_(2),exhibiting high expression levels and good stability for molecular modification.The N353A mutant effectively decreases the hydrolysis activity,and the ratio of the k_(cat) values(cyclization to hydrolysis activity)is 86.46,which is threefold that of the wild type.The E142P mutant effectively enhancesα-CD specificity,which increases the ratio of k_(cat) values(α-CD toβ-CD formation)from 2.18 of the wild-type to 2.42.The N353A/E142P mutant weakens the hydrolysis side reaction and enhancesα-CD specificity,and the proportion ofα-CD products is 53.67%,which is 15.62%higher than that of the wild-type.This research focuses on CGTase reaction and product specificities,which suggest a novel method for the industrial production ofα-CD.

环糊精葡萄糖基转移酶my20结构域删除突变体的表达和酶学性能

本实验以海洋来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)my20为研究对象,构建了D、E以及DE结构域截短突变体,通过pET-24a载体和宿主菌E.coli BL21(DE3)进行异源表达,并利用镍亲和层析柱纯化得到纯酶。以my20环化比活力为100%计,my20ΔD、my20ΔE、my20ΔDE相对环化活力分别约为197%、22%、17%,表明E结构域是CGTase催化环化反应的重要结构域,D结构域的存在可能降低了底物分子进入催化结构域的能力。my20为耐热酶,3种截短突变酶相较之下耐热性均有不同程度的降低,说明D、E结构域在CGTase耐热性方面具有重要的作用。my20在缺失了DE结构域后,催化产物中α-环糊精占比相较其他截短酶提升约8%,表明缺失DE结构域影响其产物的特异性。本实验结果可为CGTase通过结构域改造在工业生产方面发挥作用提供一定的理论基础。

罗汉果内生菌中产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选及产酶条件优化

从罗汉果内生菌中筛选高产环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的菌株进行菌种鉴定,并对其产酶条件进行优化。利用CGTase快速筛选法从罗汉果内生菌中筛选获得一株高产CGTase的菌株,编号为ND-6,经形态学和分子生物学鉴定其为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通过单因素和正交试验优化得到其产CGTase条件为1.0%环糊精作碳源,1.0%蛋白胨作氮源,初始p H值为8.0,装液量70 m L/250 m L,发酵温度40℃。在此优化条件下,菌株所产CGTase酶活达到9 753 U/m L,是优化前的1.43倍。

磁性纳米粒子的制备及环糊精葡萄糖基转移酶的固定化

采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子,并依次以正硅酸四乙酯(TEOS)为硅源、以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为硅烷偶联剂对磁性纳米粒子进行表面修饰,最终得到氨基硅烷化的磁性纳米粒子(Fe3O4@SiO2-NH2)。采用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶红外光谱分析仪(FTIR)、X射线衍射(XRD)、振动样品磁强计(VSM)和热重分析仪(TGA)对磁性纳米粒子的形态、结构进行表征。结果表明,氨基硅烷化的磁性纳米粒子具有良好的超顺磁性,结晶度高,稳定性好,粒径约为22 nm。利用该磁性材料固定化海洋环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)得,固定化酶热稳定性,对酸碱的耐受性和储存稳定性明显优于游离酶。

产环糊精葡萄糖基转移酶苦橙内生细菌的分离鉴定

为寻找产环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)的微生物新菌株,采用酚酞-甲基橙筛选平板、淀粉-碘筛选平板从苦橙内生细菌中分离获得一株可产环糊精葡萄糖基转移酶的新菌株,命名为KCEB04。形态学特征、生理生化反应、16S rDNA序列同源性分析结果表明,菌株KCEB04归属于产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。酶活测定结果表明,该菌株所产淀粉水解酶酶活为5 884.35 U/mL、α-CGTase酶活为1.65 U/mL、β-CGTase酶活为0.44 U/mL、γ-CGTase酶活为1.05 U/mL。

环糊精酶改性对淀粉结构及消化特性的影响

淀粉是人类主食的主要组分和能量供应的主要来源,提升淀粉的营养品质对人体健康具有重要价值。酶法改性具有高效、专一性强和符合清洁标签等优势,是提升淀粉品质的重要手段。作者研究了环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)和环糊精水解酶(Cyclodextrinase,CDase)对玉米淀粉的协同改性效果。分别采用CGTase单独添加、CGTase和CDase同时添加、CGTase和CDase顺序添加3种改性方式,并对改性后淀粉产物的结构以及消化性进行分析。结果表明,双酶改性使得产物中麦芽低聚糖比例显著提升,而对应的环糊精比例显著下降。经3种方式改性后淀粉结构发生明显解聚,DP 13~24、DP 25~36和DP> 37的链长比例下降,而DP <13的链长比例显著提升。此外,酶改性显著提升了抗性淀粉组分的含量。因此,CGTase和CDase双酶改性在提升淀粉营养品质中具有良好的应用前景。

高聚合度异麦芽寡糖的制备及体外益生功能评价

异麦芽寡糖(isomaltooligosaccharides,IMO)是葡萄糖以α-1,6糖苷键为主连接而成的低聚糖,具有低血糖指数特征和益生菌增殖功能。目前商业化IMO主流制备工艺得率较低,且含大量异麦芽糖,而IMO的益生功能主要归功于三糖及以上的高聚合度组分。利用黑曲霉(Aspergillus niger)来源的α-葡萄糖苷酶和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus NO2)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)进行复配制备IMO,以获得得率和聚合度提升的IMO(命名为IMOH)。通过单因素实验,考察了反应pH、温度、时间、底物种类及加酶(α-葡萄糖苷酶)量对产物得率的影响,随后探究了复配酶(CGTase)加酶量及反应时间的影响,结果表明在pH5.5、50℃的反应条件下,以300 g/L的DE值为15~20的麦芽糊精为底物,当α-葡萄糖苷酶加酶量为5 U/g(以底物质量计)、CGTase加酶量为15 U/g(以底物质量计)时,IMOH产物得率达到64.27%,其中三糖及以上的高聚合度产物质量分数为71.57%。在对产物进行结构分析后发现,产物α-1,6糖苷键键型占比为70.67%,平均相对分子质量为706,高于市售IMO50。通过肠道微生物体外发酵实验,IMOH与市售IMO50相较,对青春双歧杆菌更具有增殖效果,同时可以进一步抑制肠道条件致病菌大肠杆菌的生长,具有一定的体外益生功能。该研究提出了一种双酶复配制备IMO的新工艺,为工业制备高得率、高聚合度的IMO提供了新思路。

环糊精葡萄糖基转移酶在天然产物糖基化修饰中的应用

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)是一种可催化淀粉或多糖中α-1,4键断裂并环化形成环糊精(cyclodextrins,CDs)的α-淀粉酶。CGTase在工业上主要用于制造环糊精,近年来利用其转糖基作用改造天然产物的性质取得了令人瞩目的研究进展,正成为CGTase应用颇有前途的发展方向。本文结合CGTase的来源、蛋白结构及催化机制等相关研究,重点介绍近年来CGTase在天然产物糖基化修饰中的应用,为CGTase在该领域的深入研究及应用提供参考。