适冷β-半乳糖苷酶及其在食品工业中的应用

β-半乳糖苷酶,又称乳糖酶,广泛存在于细菌、真菌、酵母菌等微生物中,主要功能是乳糖水解和合成低聚半乳糖。利用β-半乳糖苷酶生产低乳糖牛奶等乳制品成为解决乳糖不耐受问题最有效的途径,然而常用的商业化β-半乳糖苷酶的最适反应温度大多较高,对pH的要求比较严格,存在生产成本较高、消耗能量高等问题。适冷β-半乳糖苷酶在低温下也具有较高的酶活性,广泛应用于食品行业中,尤其在乳品工业。在低温下水解乳糖,生产低乳糖或无乳糖乳制品,供乳糖不耐受者食用,可降低成本、节约能源,具有重要意义。该文综述了β-半乳糖苷酶的微生物来源、特性、催化特性的研究现状,对适冷β-半乳糖苷酶的来源、特性、耐冷机制及工业化应用进行了系统阐述,并对其前景进行了展望。

园艺作物果实β-半乳糖苷酶研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶GH35家族,参与了植物不同生长阶段细胞壁的合成与修饰,尤其对肉质水果发育和成熟过程中多糖的裂解具有重要作用。文章概述了β-半乳糖苷酶的蛋白功能、不同亚型、亚细胞定位和活性规律,重点阐述了该基因家族在园艺作物果实质地变化中的作用及相关研究进展。

普通烟草β-半乳糖苷酶基因(NtBGAL)的生信分析及其在不同组织及原核诱导的表达

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基因,随后利用生信工具软件分析其基因结构及蛋白理化性质,并采用qRT-PCR检测该基因在烟草不同组织部位(根、茎、叶和花)的表达模式,最后开展原核诱导表达、蛋白纯化及蛋白表征研究。【结果】克隆获得烟草NtBGAL基因,其与本氏烟草NbBGAL1基因同源性最高,二者具有相同的结构域(Motif);该基因定位于9号染色体上,含有18个内含子,mRNA长度为6649 bp,CDS长度为2541 bp,编码846个氨基酸,翻译的β-半乳糖苷酶属于GH35家族,NtBGAL蛋白的分子量为92.44 kDa,理论等电点(pI)为6.8,GRAVY为-0.222,定位于细胞壁。该基因在普通烟草不同组织部位的表达量为花>叶>茎>根,差异显著。在37℃下进行原核诱导,NtBGAL蛋白有明显表达;采用包涵体纯化方法获得较高纯度的NtBGAL蛋白。NtBGAL蛋白酶促反应最适温度为30~40℃,最适pH为4.0~6.5,Mn^(2+)浓度为0.05~0.15 mmol/L时对NtBGAL酶活性有增强作用。【结论】研究明确NtBGAL基因的组织表达模式及蛋白表征,为进一步通过改造NtBGAL基因,利用普通烟草生产人源化糖蛋白奠定基础。

β-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用

β-半乳糖苷酶作为一种安全无毒的酶制剂,不仅广泛应用于食品工业领域中,而且在酶工程、蛋白质工程等生物技术领域也有着很大的应用潜力。微生物发酵法作为生产β-半乳糖苷酶的主流生产方法,仍存在发酵时间较长、提取率低等问题;而利用工程菌的异源表达系统生产β-半乳糖苷酶的方式具有表达量高、成本低等优点。本文对β-半乳糖苷酶异源表达系统的基因来源、表达宿主菌、表达方式以及β-半乳糖苷酶应用价值等进行阐述,旨在为新型β-半乳糖苷酶产品的开发利用提供科学依据与理论参考。

β-半乳糖苷酶荧光探针的研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶,在食品工业、基因工程、酶工程、蛋白质工程、生物医学等领域发挥着重要作用。β-半乳糖苷酶活性及含量的异常与癌症的发生发展密切相关,因此该酶检测对早期癌症诊断有着重要意义。传统酶活性检测方法具有一定的局限性,无法实现对β-半乳糖苷酶的原位无损检测。荧光探针因灵敏度高、选择性好、可用显微镜直接观察、分辨率高、响应时间短、操作方便、成本低等优点深受研究者青睐。在简述荧光探针设计原理的基础上,对近年来β-半乳糖苷酶荧光探针的设计合成研究进展进行了综述,阐述了β-半乳糖苷酶荧光探针在生物成像、早期癌症诊断等应用进展,为β-半乳糖苷酶高效检测技术的研究提供了帮助。

芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60 kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对o NP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的:本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)提供基础。方法:从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶(PpBgal42A)基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果:PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适pH和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0~9.5范围内和4~35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31.6%。结论:PpBgal42A是一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,可水解乳糖并合成低聚半乳糖,具有潜在应用价值。

马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶合成条件的优化及其酶学性质表征

β-半乳糖苷酶是广泛使用的食品添加剂,主要用于降解乳制品中的乳糖,缓解乳糖不耐受症状。该研究对实验室保藏菌株马克斯克鲁维酵母的发酵条件进行了优化。在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米浆干粉、40℃、初始pH 6.5、150 r/min的条件下,粗酶液的酶活力为26.3 U/mL,表明该菌株具有利用廉价碳氮源高效生产β-半乳糖苷酶的潜力。通过DEAE阴离子交换层析进一步纯化得到比活力为124.09 U/mg的纯化酶。纯化后酶的最适温度40℃,最适pH 6,Km为5.28 mmol/L,kcat为4.74 s^(-1)。此外,发现该酶受Mg^(2+)的促进,在20~40℃表现出优异的热稳定性,40℃下30 min仍能保持95.6%的活力。因此,马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶比乳酸克鲁维酵母的热稳定性更好,具有潜在的工业应用潜力。

β-半乳糖苷酶及多聚半乳糖醛酸酶对桃果实成熟软化的影响

以雨花3号桃果实为试验材料,采用气相色谱法测定不同成熟时期桃果实的乙烯释放量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性的变化,并分析β-半乳糖苷酶(-βG al)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的变化,探讨-βG al和PG对桃果实成熟软化的影响。结果表明:在桃果实成熟软化过程中,具有明显的乙烯跃变高峰,ACC合成酶和ACC氧化酶活性变化趋势与乙烯变化相一致;PG活性高峰与乙烯释放高峰同时出现于成熟度Ⅳ,而-βG al活性高峰出现于成熟前期(即成熟度Ⅰ);-βG al不同于PG,其作用主要与桃果实成熟前期果实的软化启动密切相关。

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖

通过水解活性和转糖基活性筛选,从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829.综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果,将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)2-37-4-1.确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖1%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%,培养条件为37℃摇床培养18 h;碳源实验证明,该菌株β-半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为pH7.5、50 mmol/L(磷酸缓冲液)配制的40%乳糖溶液,55℃反应24 h.转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%,双糖(包括乳糖和转移二糖)33.02%,葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%.

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙带菜中的稳定表达

借鉴海带遗传转化模式 ,利用基因枪法将 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入裙带菜雄配子体中 ,一部分诱导形成营养增殖的丝状体 ,另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明 5 %的孢子体个体和 30 %的丝状体细胞表现了lacZ的稳定表达 ,利用PCR和PCR Southern检测得到了预期的阳性信号。本文结果提示了利用基因枪转化方法 。

超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶活力的研究

采用超声波破碎法对嗜酸乳杆菌A和B产生的β-半乳糖苷酶进行提取,并以邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物测定了β-半乳糖苷酶的活力。通过单因素试验和正交试验,选出了超声波破碎的最佳工艺条件。实验表明,嗜酸乳杆菌A在工作时间7.6min,工作/间歇为28s/20s,温度36℃时,超声波对细胞的破碎效果较好,此条件下破碎后,A株产生的β-半乳糖苷酶活力为5.963μmolONP/L·min。嗜酸乳杆菌B在工作时间6.8min,工作/间歇为20s/20s,温度37℃时效果较好,产生的β-半乳糖苷酶活力为6.683μmolONP/L·min。因此,嗜酸乳杆菌具有较高产生β-半乳糖苷酶的能力。

β-半乳糖苷酶高产菌株的诱变筛选及其发酵培养

本文系统地报道了以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis 2883)作为出发菌株,经诱变而获得β一半乳糖苷酶高产菌株(K·lactis 2—90—1)和该菌株的最适培养基选择以及其最佳发酵工艺条件的确定等研究内容。

β-半乳糖苷酶的研究与应用

本文对β－半乳糖苷酶进行了比较全面的论述，包括β－半乳糖苷酶的研究概况、来源、性质及其应用，比较了细菌、酵母菌、霉菌产生的β－半乳糖苷酶的特性，并对其应用前景进行了分析。

普通酸奶制品在贮存过程中发酵剂菌的β-半乳糖苷酶活性测定及变化规律研究

采用菌体细胞蛋白重来测定β-半乳糖苷酶活性是比较精确的方法。β-半乳糖苷酶为胞内酶,通过对溶菌酶、超声波、丙酮干粉三种破壁方法比较,确定用超声波破壁法对乳酸菌细胞破壁。发酵剂菌体的β-半乳糖苷酶活性随酸奶样品贮存时间的延长而下降,由最初的0.9707下降到0.468(第15d)。确定β-半乳糖苷酶为导致酸奶制品发生后酸化的关键酶。

山茱萸多糖对HDF细胞β-半乳糖苷酶及p16表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对抗HDF细胞衰老的作用及其可能的调控机制。方法体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF),实验组从40代开始加多糖含药血清,观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,分光光度法检测β-半乳糖苷酶活性,免疫组化法检测p16蛋白的表达。结果衰老组细胞活力下降,β-半乳糖苷酶含量升高,p16蛋白表达阳性细胞数升高;山茱萸多糖可提高细胞活力、降低β-半乳糖苷酶含量,p16蛋白表达阳性细胞数下降。结论山茱萸多糖可通过改变p16的表达而发挥其抗HDF细胞衰老作用。

嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株异源二聚体β-半乳糖苷酶的克隆表达

嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)的异源二聚体β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶2家族,由两个部分重叠、协同翻译的基因编码(lacL和lacM)。【目的】克隆表达该酶并测定其酶学特性。【方法】参照已全基因组测序的嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,以嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株基因组为模板,将lacL的RBS到lacM的终止子之间的序列(2834bp)克隆到pQE31质粒上,并电转化JM109菌株。以下列步骤纯化表达产物:硫酸铵分级沉淀、阴离子交换、亲和层析和凝胶排阻层析。以凝胶排阻层析测定纯化酶的天然分子量,以邻硝基苯基半乳糖为底物测定其酶学特性。【结果】实现了该酶在JM109菌株中的可溶性表达。其氨基酸序列有一处不同于嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,即其大亚基(LacL)的第512位氨基酸不是组氨酸而是精氨酸。纯化酶比活力为226U/mg蛋白,天然分子量为96.3±4.6kDa,最适pH为7,最适温度为49℃,Km和Vmax值分别是:2.18±0.12mmol/L,273±5U/mg蛋白。

苹果β-半乳糖苷酶对细胞壁多糖降解特性的研究

以苹果为试验材料,提取细胞壁结合型β-半乳糖苷酶,并通过羟磷灰石柱色谱法分离出4种β-半乳糖苷酶同工酶(GALase ～ ),研究β-半乳糖苷酶同工酶对阿拉伯半乳聚糖和Na2CO3-1、KOH-3、细胞壁残渣等细胞壁多糖组分的降解特性。结果表明:GALase 、 对细胞壁多糖具有较强的分解能力,而GALase 、 的分解能力微弱,说明β-半乳糖苷酶的GALase 、 与细胞壁多糖的降解以及果实的软化密切相关。

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 p H分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn2 +、Fe3 +、Cu2 +抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β- D糖苷键具有高度专一性 ,与糖苷键相连的配基对酶活力也有很大影响。在 55℃ ,酶作用于底物 ONPG和乳糖的米氏常数 Km分别 2 .6 3mmol/L和 4 .93mmol/L,最大反应速度分别为 1.93× 10 -5mmol.min-1.mg-1protein和 6 .54× 10 -5mmol.min-1.mg-1protein。乳糖的水解产物葡萄糖抑制酶活力 ,其抑制常数 2 .4 7mmol/L ,但半乳糖没有这种效应。另外 ,该酶具有转半乳糖苷的活力 ,在水解乳糖过程中 ,生成包括三、四糖的半乳糖低聚糖。

β-半乳糖苷酶研究进展

随着生物技术的发展,β-半乳糖苷酶不仅在食品工业中的用途越来越广泛,在生物技术领域如基因工程、酶工程、蛋白质工程等方面也都发挥着重要作用,并开始广泛应用于医药等领域。文章对β-半乳糖苷酶的性质、来源、作用机理、应用情况等进行概述,着重介绍了β-半乳糖苷酶在研究上的新进展和应用上的一些新领域。