普通烟草β-半乳糖苷酶基因(NtBGAL)的生信分析及其在不同组织及原核诱导的表达

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基因,随后利用生信工具软件分析其基因结构及蛋白理化性质,并采用qRT-PCR检测该基因在烟草不同组织部位(根、茎、叶和花)的表达模式,最后开展原核诱导表达、蛋白纯化及蛋白表征研究。【结果】克隆获得烟草NtBGAL基因,其与本氏烟草NbBGAL1基因同源性最高,二者具有相同的结构域(Motif);该基因定位于9号染色体上,含有18个内含子,mRNA长度为6649 bp,CDS长度为2541 bp,编码846个氨基酸,翻译的β-半乳糖苷酶属于GH35家族,NtBGAL蛋白的分子量为92.44 kDa,理论等电点(pI)为6.8,GRAVY为-0.222,定位于细胞壁。该基因在普通烟草不同组织部位的表达量为花>叶>茎>根,差异显著。在37℃下进行原核诱导,NtBGAL蛋白有明显表达;采用包涵体纯化方法获得较高纯度的NtBGAL蛋白。NtBGAL蛋白酶促反应最适温度为30~40℃,最适pH为4.0~6.5,Mn^(2+)浓度为0.05~0.15 mmol/L时对NtBGAL酶活性有增强作用。【结论】研究明确NtBGAL基因的组织表达模式及蛋白表征,为进一步通过改造NtBGAL基因,利用普通烟草生产人源化糖蛋白奠定基础。

园艺作物果实β-半乳糖苷酶研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶GH35家族,参与了植物不同生长阶段细胞壁的合成与修饰,尤其对肉质水果发育和成熟过程中多糖的裂解具有重要作用。文章概述了β-半乳糖苷酶的蛋白功能、不同亚型、亚细胞定位和活性规律,重点阐述了该基因家族在园艺作物果实质地变化中的作用及相关研究进展。

适冷β-半乳糖苷酶及其在食品工业中的应用

β-半乳糖苷酶,又称乳糖酶,广泛存在于细菌、真菌、酵母菌等微生物中,主要功能是乳糖水解和合成低聚半乳糖。利用β-半乳糖苷酶生产低乳糖牛奶等乳制品成为解决乳糖不耐受问题最有效的途径,然而常用的商业化β-半乳糖苷酶的最适反应温度大多较高,对pH的要求比较严格,存在生产成本较高、消耗能量高等问题。适冷β-半乳糖苷酶在低温下也具有较高的酶活性,广泛应用于食品行业中,尤其在乳品工业。在低温下水解乳糖,生产低乳糖或无乳糖乳制品,供乳糖不耐受者食用,可降低成本、节约能源,具有重要意义。该文综述了β-半乳糖苷酶的微生物来源、特性、催化特性的研究现状,对适冷β-半乳糖苷酶的来源、特性、耐冷机制及工业化应用进行了系统阐述,并对其前景进行了展望。

酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

目的建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法。方法采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定最佳酶活测定条件。结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)>8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109中差异有统计学意义(P<0.001),而在Y187中没有明显差异(P>0.05)。结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定。

以β-半乳糖苷酶为报告基因的原核启动子检测体系构建

目的:以β-半乳糖苷酶为报告基因构建原核启动子检测体系。方法:以由质粒pDL扩增获得的bgaB基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBEB。将组成型启动子P43和诱导型启动子Pspac克隆入pBEB,得到重组表达载体pBEBP43和pBEBPspac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。结果:两种不同类型的启动子均能在大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌1A751中启动bgaB基因的表达。结论:成功构建具有较为广泛适用性的原核启动子检测体系。

红球菌启动子识别及β-半乳糖苷酶报告基因表达

红球菌属在生物降解、生物修复、生物转化和生物表面活性剂等领域得到了日益广泛的应用。本研究以红球菌-大肠杆菌穿梭质粒pNV18.1为载体,以腈水合酶为模式酶,研究了大肠杆菌tac、lacZ启动子和红球菌酰胺酶启动子(ami-1/ami-2)在红球菌中的启动效率。结果表明,启动子Ptac、Pami-1(7bpSD-ATG间隔)、Pami-2(13bpSD-ATG间隔)和PlacZ在紫红红球菌ATCC33278中启动表达腈水合酶的比酶活分别是野生菌株的7.5、6.3、5.3和1.8倍,表明这些启动子都可以被红球菌的RNA聚合酶所成功识别。采用PlacZ启动子在红球菌宿主中启动β-半乳糖苷酶报告基因(lacZ),结果表明,lacZ能够在红球菌中高效表达,是优选的红球菌报告基因。

基于β-半乳糖苷酶为报告基因的耐辐射异常球菌启动子检测载体构建

耐辐射异常球菌是一种超强电离辐射抗性的微生物,其含有大量的胁迫反应相关蛋白及其转录调控因子,在适应环境变化和各种胁迫反应中发挥着重要作用。为深入分析该菌的抗逆基因在不同胁迫下的功能,以β-半乳糖苷酶为报告基因构建了耐辐射异常球菌启动子检测体系。以耐辐射异常球菌基因组为模板扩增gro EL、hsp20、relA和relQ启动子片段,将其连接到到大肠杆菌-耐辐射异常球菌穿梭载体pRADZ1上,构建成具有启动子活性检测功能的重组质粒pRADZ-P_(groE)、pRADZ-P_(hsp20)、pRADZ-P_(relA)和pRADZ-P_(relQ),并将其转化至耐辐射异常球菌,测定β-半乳糖苷酶酶活。结果显示,这些启动子能在耐辐射异常球菌中启动Lac-Z报告基因的表达,并受到胁迫条件的诱导调控。耐辐射异常球菌启动子活性检测方法构建为该菌株特异性胁迫应答系统的研究提供了重要的实验基础。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂ACY1215通过调控能量代谢酶保护脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的急性肝衰竭小鼠机制研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂ACY1215对急性肝衰竭(ALF)小鼠的保护作用及其可能的作用机制。方法将30只小鼠随机分为对照组、模型组和ACY1215处理组,采用脂多糖和D-氨基半乳糖联合腹腔注射诱导小鼠ALF模型,常规行血生化和组织病理学检查,采用Western blot法检测肝组织苹果酸脱氢酶1(MDH1)、异柠檬酸脱氢酶(IDH1)和果糖-2,6-二磷酸酶2(PFKFB2)及白介素-1β(IL-1β)和IL-18分子蛋白的表达。结果肝组织病理学检查显示,ALF模型制备成功,而ACY1215干预组肝组织病理学损害显著减轻;模型组血清ALT、AST和TBIL水平分别为(3743.5±655.9)U/L、(2539.4±488.1)U/L和(89.56±7.2)μmol/L,显著高于对照组【分别为(34.5±7.6)U/L、(32.3±9.3)U/L和(6.2±2.4)μmol/L,P<0.05】,而ACY1215处理组各项指标均显著降低【分别为(951.5±328.9)U/L、(475.3±131.24)U/L和(38.41±9.5)μmol/L,P<0.05】;模型组小鼠肝组织MDH1和IDH1表达较对照组显著减弱,PFKFB2、IL-18和IL-1β表达较对照组显著增强,而ACY1215干预组肝组织MDH1和IDH1表达较模型组显著增强,而PFKFB2、IL-18和IL-1β表达较模型组显著减弱。结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂ACY1215可以通过对能量代谢酶的调节发挥保护ALF小鼠的作用。

耐热性α-半乳糖苷酶突变体的筛选及酶学性质研究

研究旨在改造株链球菌来源的α-半乳糖苷酶基因Gal_(2)7A,获得耐热性高的突变体。在常规PCR体系中加入不同水平的MnCl_(2),将基因克隆至载体pGAPZαA并成功构建表达酶产物的重组质粒pGAPZαA-Gal_(2)7A。将线性化的重组质粒电转至毕赤酵母GS115,在含有100 g/L博来霉素的YPDS平板上筛选耐热性提高的突变体,通过pNPG的方法测定重组酶的酶学性质为最适温度65℃,最适pH值6.5,Ag^(2+)、Hg^(2+)对重组酶的酶学活性具有明显的抑制作用,Cu^(2+)对重组酶的酶活性具有促进作用。研究表明,试验成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株29和54,在55℃保温10 min与同等条件下的野生型进行对比,加热前后的保留酶活比的增幅大于45%。

日粮添加α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪生长性能、养分消化率及血清免疫指标的影响

本试验将不同水平的α-半乳糖苷酶添加到断奶苏姜仔猪日粮中,研究对其生长性能、血清免疫指标和养分消化率的影响。试验将108只断奶苏姜仔猪平均分为4组,每组3个重复,每个重复9只仔猪,分别为对照组(喂养普通日粮)、试验Ι组(日粮+50U/kgα-半乳糖苷酶)、试验Ⅱ组(日粮+100U/kgα-半乳糖苷酶)、试验Ⅲ组(日粮+200U/kgα-半乳糖苷酶),试验期为40d。结果发现:与对照组相比,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪的末重、平均日增重及料重比均有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶对提高断奶苏姜仔猪的生长性能效果最显著(P<0.05),断奶苏姜仔猪平均日增重比对照组提高了9.07%,料重比较对照组降低了8.82%;其次,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪血清中的IgA、IgG、IgM等免疫指标均有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶的试验组免疫指标与对照组相比差异最显著(P<0.05),IgA、IgG、IgM分别提高16.5%、21.6%和52.9%。最后,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶,对断奶苏姜仔猪的养分消化率也有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶的试验组养分消化率与对照组相比差异最显著(P<0.05),粗纤维消化率和粗蛋白质消化率分别比对照组提高8.29%和8.02%。结果表明,在日粮中添加100U/kg的α-半乳糖苷酶,对断奶苏姜仔猪的生长促进效果最明显,可使断奶苏姜仔猪的饲料效率最佳。

β-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用

β-半乳糖苷酶作为一种安全无毒的酶制剂,不仅广泛应用于食品工业领域中,而且在酶工程、蛋白质工程等生物技术领域也有着很大的应用潜力。微生物发酵法作为生产β-半乳糖苷酶的主流生产方法,仍存在发酵时间较长、提取率低等问题;而利用工程菌的异源表达系统生产β-半乳糖苷酶的方式具有表达量高、成本低等优点。本文对β-半乳糖苷酶异源表达系统的基因来源、表达宿主菌、表达方式以及β-半乳糖苷酶应用价值等进行阐述,旨在为新型β-半乳糖苷酶产品的开发利用提供科学依据与理论参考。

β-半乳糖苷酶荧光探针的研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶,在食品工业、基因工程、酶工程、蛋白质工程、生物医学等领域发挥着重要作用。β-半乳糖苷酶活性及含量的异常与癌症的发生发展密切相关,因此该酶检测对早期癌症诊断有着重要意义。传统酶活性检测方法具有一定的局限性,无法实现对β-半乳糖苷酶的原位无损检测。荧光探针因灵敏度高、选择性好、可用显微镜直接观察、分辨率高、响应时间短、操作方便、成本低等优点深受研究者青睐。在简述荧光探针设计原理的基础上,对近年来β-半乳糖苷酶荧光探针的设计合成研究进展进行了综述,阐述了β-半乳糖苷酶荧光探针在生物成像、早期癌症诊断等应用进展,为β-半乳糖苷酶高效检测技术的研究提供了帮助。

溶酶体半乳糖脑苷酯酶的作用机制及疾病

溶酶体贮积症(lysosomal storage diseases,LSD)是一类遗传性代谢障碍疾病,其发病机制主要源于溶酶体酸性水解酶的基因突变,导致酶的功能缺陷,进而触发生物大分子在溶酶体内的异常积累,继而对细胞、组织及器官功能造成显著损害。β-半乳糖脑苷酯酶(galactocerebrosidase,GALC)的突变或缺失导致鞘氨醇半乳糖苷(galactosylsphingosine)的累积,造成了进行性的脱髓鞘病变,诱发神经鞘脂贮积症-克拉伯病(Krabbe disease),其在疾病调控中的具体机制尚未完全阐明。目前,越来越多的有关GALC基因的致病突变被报道,结合GALC蛋白的三维结构解析,已逐渐了解GALC蛋白的突变造成克拉伯病的机制,这将为开发相关治疗药物提供有力的证据。此外,GALC在不同的肿瘤进程中扮演着双重角色,一些癌症中充当着抑癌因子的作用,而在另一些癌症中则发挥着致癌因子的作用,然而剖析GALC对癌症的影响仍需进一步深入的研究,这将为GALC作为潜在的肿瘤促进或抑制的靶点提供借鉴。GALC还与多种神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病、帕金森氏病以及多发性硬化症有关。由于GALC作用机制的复杂性,目前,针对GALC缺乏所致的克拉伯病的治疗主要通过单一模式疗法(single-modality therapies)及多模式疗法(multi-modality therapies),但要开发出真正有效的治疗方法,仍需深入研究GALC基因缺陷导致的发病机制。本文综述了GALC的结构和功能特性,汇总并讨论了其在神经系统及肿瘤发生发展中的作用及相关研究的最新进展,旨在为未来深入探讨GALC的调控机制及开发治疗相关疾病的创新药物提供理论基础和参考。

芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60 kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对o NP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的:本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)提供基础。方法:从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶(PpBgal42A)基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果:PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适pH和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0~9.5范围内和4~35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31.6%。结论:PpBgal42A是一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,可水解乳糖并合成低聚半乳糖,具有潜在应用价值。

生物合成α-半乳糖苷酶的研究进展

α-半乳糖苷酶是一种外切糖苷酶,可用于改善和消除饲料及豆制食品中的抗营养因子,良好的生物催化能力使其在食品、饲料和医药等领域显示出巨大潜力,但目前α-半乳糖苷酶的微生物发酵产量及活性并不高。该文在阐述α-半乳糖苷酶的催化机制的基础上,对α-半乳糖苷酶的微生物来源,产α-半乳糖苷酶菌株的发酵以及该酶的异源表达和分离纯化进行了综述,并对开发低成本、高活性和高产量的α-半乳糖苷酶生产工艺进行展望,以期显著提高α-半乳糖苷酶的生产水平,为后续对α-半乳糖苷酶的产业化研究奠定基础。

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α 半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上 ,尝试了基因工程α 半乳糖苷酶在 5L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α 半乳糖苷酶的研究。在 4L无机盐培养基中接种 0 .4LpPIC9K Gal GS115培养物 ,最终得到 3 .5L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为 2 .1g L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点 ,设计了如下的纯化流程 :离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带 ,总回收率 41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后 ,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明 ,从发酵液中纯化的α 半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α 半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙带菜中的稳定表达

借鉴海带遗传转化模式 ,利用基因枪法将 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入裙带菜雄配子体中 ,一部分诱导形成营养增殖的丝状体 ,另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明 5 %的孢子体个体和 30 %的丝状体细胞表现了lacZ的稳定表达 ,利用PCR和PCR Southern检测得到了预期的阳性信号。本文结果提示了利用基因枪转化方法 。

海栖热袍菌耐高温β-半乳糖苷酶基因的克隆和表达

本文主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因(TM_0310)。以海栖热袍菌基因组DNA(GenBank登录号AE000512)为模板,设计特异性引物带有NcoI-HindIII酶切位点,克隆得到的该基因全序列为2019bp,编码672个氨基酸,分子量为78.972kD。该基因编码的蛋白质属于42族,根据氨基酸同源性分析,该β-半乳糖苷酶与Thermotoga petrophila RKU-1来源的假想的β-半乳糖苷酶(GenBank登录号ABQ46628.1)以及Thermotoga sp.RQ2来源的β-半乳糖苷酶(GenBank登录号EDQ29256.1)同源性最高,均为95%。重组转化子经诱导酶比活可达2.08U/mg蛋白。粗酶液经过80℃热处理10min,酶活残留70%以上,表明该酶有很好的耐热性,在高温工业环境中有良好应用前景。

香蕉果实软化相关β-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达分析(英文)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)通过分解细胞壁半纤维素切除半乳糖键而参与果实软化。为了阐明香蕉(Musasp.)果实成熟过程中的软化与细胞壁代谢酶β-半乳糖苷酶基因表达之间的关系,采用RT-PCR方法,从成熟香蕉果实果肉中分离了编码β-半乳糖苷酶基因的部分cDNA(MA-Gal),序列分析表明,MA-Gal包含927bp,编码309个氨基酸,包含5 个β-半乳糖苷酶结构域(典型真核生物中β-半乳糖苷酶包含7 个结构域),推导的MA-Gal 蛋白质中有β-半乳糖苷酶蛋白的催化活性部位GGPIILSQIENEY(F);系统进化树分析结果表明MA-Gal属于第一类β-半乳糖苷酶基因(该类主要在果实中表达);β-半乳糖苷酶活性和硬度的变化表明其与香蕉果实硬度变化密切相关;Northern 分析显示,跃变前期的果肉中,MA-Gal 基因的表达量很低,后随着果实的软化表达量不断增加,并在呼吸跃变后达到最高。所有结果表明,MA-Gal 参与香蕉果实成熟过程中的软化。