D-半乳糖致亚急性衰老小鼠模型肝mtDNA的改变

目的:研究D半乳糖所致小鼠亚急性衰老模型动物肝线粒体DNA(mtDNA)的缺失改变,从分子水平观察此种动物造模后的改变,论证其可行性.方法:每日以50g/LD半乳糖颈背部皮下注射,连续造模45d,诱导亚急性衰老动物模型,应用PCR法检测实验动物mtDNA固定片段的缺失情况.结果:D半乳糖所致衰老模型组小鼠MDA水平显著高于对照组和青年组(P<0.05).模型组小鼠肝脏mtDNA发生固定片段缺失改变,β半乳糖苷酶染色呈阳性改变,而对照组和青年组小鼠没有发生改变.结论:D半乳糖所致亚急性衰老模型小鼠不仅在形态学而且在mtDNA分子水平上与正常衰老小鼠基本一致.

人参皂苷Rg_1诱导人白血病K562细胞复制性衰老的机制

目的探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导人白血病K562细胞复制性衰老特征性变化。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选Rg1对K562细胞增殖抑制的最佳浓度及时间,以此浓度和作用时间诱导K562细胞衰老。流式细胞术检测Rg1对细胞增殖周期的影响;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测阳性细胞百分率;Southern blotting检测端粒长度;Western blotting检测复制性衰老信号通路相关P21、P53与Rb蛋白表达;透射电镜观察人白血病K562细胞衰老超微形态学改变。结果 Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖,其最佳作用浓度为20μmol/L,时间为48h;诱导后的K562细胞阻滞于G2/M期;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加(P<0.05);复制性衰老通路相关蛋白P21、P53和Rb表达上调(P<0.05);端粒长度缩短加速(P<0.05);经诱导细胞呈现胞体增大,溶酶体体积增大、数目增多,线粒体体积增大等衰老形态学变化。结论 Rg1可能经由p53-p21-Rb信号通路诱导K562细胞呈现复制性衰老特征。

佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响

背景:有效的中医药治疗可以缓解内皮细胞的衰老,传统的中医药提取较困难,佛手柑内酯提纯简练,价格经济,关于佛手柑内酯在延缓内皮细胞衰老的研究中尚未见报道。目的:观察佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响。方法:将人脐静脉内皮细胞采用过氧化氢处理建立衰老细胞模型,并用0.1,1,10μmol/L佛手柑内酯预处理。通过Western blot法检测各处理组pR b,pA mpk,pS 6,LC3-Ⅱ,Beclin-1蛋白,β-半乳糖甘酶染色确定各组衰老细胞数,细胞免疫荧光检测pS 6阳性细胞数。结果与结论:(1)Western blot结果、β-半乳糖苷酶染色法和免疫荧光检测结果:采用佛手柑内酯后预处理的衰老细胞模型中,pS 6,pR b蛋白表达降低,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数和免疫荧光pS 6阳性细胞数减少,pA mpk,Beclin-1,LC3-Ⅱ蛋白表达升高(P<0.05);(2)结果说明,佛手柑内酯预处理对双氧水诱导的人脐静脉内皮细胞有一定抗衰老作用。

超声微泡促进肿瘤细胞报告基因转染

目的 探讨超声破坏微泡造影剂后对β-半乳糖苷酶报告基因在人肝癌细胞(QGY)中转染的影响。方法 将培养QGY细胞转于2 4孔培养板后,分为5组,分别为单纯加入质粒组(D) ;质粒+微泡组(D +M) ;质粒+超声组(D +U) ;质粒+超声+微泡组(D +U +M) ;脂质体+质粒组(L +D) ;进行β-半乳糖苷酶质粒DNA的转染。2d后,进行β-半乳糖苷酶染色,测定各组细胞转染率。结果 单纯质粒组细胞转染率为4.92 % ;质粒+微泡组转染率为6 742 % ;质粒+超声组转染率为2 9.73 % ;质粒+超声+微泡组转染率为5 0 .88% ;脂质体+质粒组转染率为12 .15 % ;结论 超声破坏微泡造影剂可促进报告基因β-半乳糖苷酶质粒在QGY细胞的转染,为肿瘤基因治疗提供一种新型基因转移系统。

小鼠造血干细胞体外衰老模型的构建及其相关生物学

目的建立造血干细胞(HSCs)体外衰老模型,探讨其衰老的相关生物学调控机制,为寻找延缓HSC衰老方法奠定基础。方法用免疫磁性分选法分离、纯化小鼠Sca-1+HSCs,用流式细胞术鉴定分选细胞纯度,免疫荧光检测分选细胞Sca-1+表达。用三丁基过氧化氢(t-BHP)100μmol/L诱导Sca-1+HSCs 6h,建立HSCs衰老体外模型。采用造血祖细胞集落培养,细胞周期分析和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察衰老HSCs的生物学特点。DNA印迹法(Southern blotting)与TRAP-PCR SYBR Green染色法检测HSCs端粒长度和端粒酶活性。RT-PCR法检测衰老相关基因p16Ink4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1 mRNA的表达水平。结果免疫磁性分选法分离、纯化的Sca-1+HSCs纯度可达(87.33±1.25)%。100μmol/L的t-BHP作用Sca-1+HSCs 6h,其体外培养形成造血祖细胞集落能力,自我更新及多向分化潜能显著低于对照组,处于G1期细胞比例增加,SA-β-gal染色阳性细胞数增加。衰老Sca-1+HSCs的端粒缩短,端粒酶活性下降,p16Ink4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA的表达水平明显增高。结论用t-BHP能建立Sca-1+HSCs体外细胞衰老模型,提示p16Ink4a-Rb通路和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1通路在t-BHP诱导Sca-1+HSCs衰老过程中发挥重要作用。

体外培养不同代次人成纤维细胞的衰老程度

目的:探讨体外培养不同代次人成纤维细胞的衰老程度,为组织工程化皮肤提供合适的种子细胞。方法:实验于2000-09/2002-06在潍坊医学院整形外科研究所完成。取6～8岁正常男性儿童20例包皮环切术切除的健康包皮组织,将包皮二倍体成纤维细胞进行传代培养,以不同代次(P0,P5,P10,…,P65)的细胞为实验对象,通过倒置相差显微镜、透射电镜、衰老相关β-半乳糖苷酶染色一系列检测方法,对不同代次成纤维细胞的衰老程度进行观察。结果:①成纤维细胞的形态学:P45以内成纤维细胞生长迅速,两三天即呈汇合状态,细胞排列紧密,多呈放射状、编织状或漩涡状走行,有的交叉重叠生长。P46以后细胞排列不规则,体积较大,形状扁平,胞浆区域增大,胞质突起多而大,胞内出现颗粒和空泡,边界不清,形态不规则;成批的细胞出现固缩、脱落,有离壁漂起的现象。②透射电镜结果:P0～P40:成纤维细胞胞质内有丰富的粗面内质网;细胞核大,核仁明显;细胞表面有许多短小突起,可见微绒毛和胞浆皱褶。P41～P65:细胞核/浆比例减小,细胞表面突起和微绒毛减少;核膜内折,有凋亡现象。③细胞生物学行为的改变:P60增殖速度较P10明显减慢。P10最大增殖数为47.3×105,对数生长期在3～6d,细胞倍增时间为2.18d;P60最大增殖数为8.5×104,对数生长期在4.0～7.5d,群体倍增时间为3.86d。④衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果:与P10相比,P60中阳性细胞率大为增强(阳性细胞率为4%和60%);直线相关分析结果显示,β-半乳糖苷酶染色的阳性率和细胞代龄之间呈显著正相关(r=0.92,P<0.01)。结论:各代成纤维细胞老化程度不同,46代后的细胞老化明显,不适合作为组织工程化皮肤的种子细胞。

外源性Rb基因对神经细胞衰老的影响

目的 观察外源性 Rb基因对神经细胞衰老的影响 ,并探讨 Rb基因对神经细胞 P2 1基因表达的调控。方法 用外源性 Rb基因重组腺病毒载体感染体外培养的胚胎大鼠神经细胞 ,以β-半乳糖苷酶染色观察神经细胞的衰老变化 ,用免疫组化法测定 P2 1蛋白表达水平。结果 外源性Rb基因导入神经细胞后 ,P2 1蛋白水平显著增高 ,与衰老相关的 β-半乳糖苷酶表达也增加。结论 Rb基因可能通过上调 P2 1基因表达促进神经细胞衰老。

造血干细胞衰老模型的建立及其评价

造血干细胞衰老模型的建立是研究造血干细胞衰老机理与延缓其衰老的重要途径,目前可通过体内和体外两种途径实现。体内衰老模型可通过供体造血干细胞在受体内连续性移植建立,体外衰老模型可通过白消安、三丁基过氧化氢等致衰老药物和电离辐射等方法建立。造血干细胞衰老模型建立后,可通过其自我更新和多向分化能力检测、细胞周期分析、β-半乳糖苷酶染色等方法检测和评价造血干细胞的衰老变化,并应用Southern bloting,Western bloting,RT-PCR等方法检测造血干细胞衰老相关基因和蛋白变化。本文就造血干细胞衰老模型的建立以及评价方法综述如下。

钩藤总碱干预内皮细胞衰老的实验研究

目的:探讨钩藤总碱拮抗内皮细胞衰老、保护血管内皮细胞和防治动脉粥样硬化的可能机制。方法:借助离体内皮细胞建立衰老模型,通过衰老内皮细胞半乳糖苷酶染色及细胞凋亡率的测定,观察钩藤总碱的干预作用。结果:β-半乳糖苷酶染色显示各组的衰老细胞阳性率均在90%以上,造模成功;钩藤总碱能明显促进衰老内皮细胞的凋亡(P<0.05)。结论:钩藤总碱能明显促进衰老内皮细胞的凋亡,防止动脉硬化。

正常人成纤维细胞老化过程中活性氧水平的变化

目的研究正常人成纤维细胞在老化过程中细胞活性氧水平的变化。 方法取常规体外培养的原代人成纤维细胞 ,按不同传代数 (PD2 2 - 2 4和PD5 0 - 5 2 )分为两组 ,代表老化过程中两个阶段 (早期和中—晚期 ) ,用流式细胞仪检测罗丹明 12 3显示细胞活性氧水平 ,同时用β -半乳糖苷酶组化染色 ,形态观察衰老细胞 ,用群体倍增时间和流式细胞周期分析显示细胞增殖情况。 结果中—晚期细胞中衰老细胞增多 ,活性氧水平增高 ,未出现增殖阻滞。 结论正常人成纤维细胞在老化过程中细胞活性氧水平呈升高趋势。

藻红蛋白诱导人乳腺癌MCF-7细胞衰老研究

目的:研究藻红蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞的诱导衰老作用。方法:采用MTT法检测藻红蛋白对MCF-7细胞的生长抑制作用,采用倒置显微镜观察形态学变化,酸性β-半乳糖苷酶染色法和衰老相关异染色质聚集检测藻红蛋白诱导人乳腺癌MCF-7细胞衰老作用。结果:MTT法结果显示,藻红蛋白对体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7具有明显的生长抑制作用,IC50为134.87μg/mL。结果发现藻红蛋白作用72h后,细胞呈现变大变扁平,细胞内形成空泡、颗粒增多等明显衰老形态。在倒置显微镜下观察,酸性β-半乳糖苷酶染色呈阳性;在荧光显微镜下观察,DAPI染色出现衰老相关异染色质聚集现象。结论:藻红蛋白可通过诱导MCF-7细胞衰老达到抗肿瘤作用。