普通烟草β-半乳糖苷酶基因(NtBGAL)的生信分析及其在不同组织及原核诱导的表达

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基因,随后利用生信工具软件分析其基因结构及蛋白理化性质,并采用qRT-PCR检测该基因在烟草不同组织部位(根、茎、叶和花)的表达模式,最后开展原核诱导表达、蛋白纯化及蛋白表征研究。【结果】克隆获得烟草NtBGAL基因,其与本氏烟草NbBGAL1基因同源性最高,二者具有相同的结构域(Motif);该基因定位于9号染色体上,含有18个内含子,mRNA长度为6649 bp,CDS长度为2541 bp,编码846个氨基酸,翻译的β-半乳糖苷酶属于GH35家族,NtBGAL蛋白的分子量为92.44 kDa,理论等电点(pI)为6.8,GRAVY为-0.222,定位于细胞壁。该基因在普通烟草不同组织部位的表达量为花>叶>茎>根,差异显著。在37℃下进行原核诱导,NtBGAL蛋白有明显表达;采用包涵体纯化方法获得较高纯度的NtBGAL蛋白。NtBGAL蛋白酶促反应最适温度为30~40℃,最适pH为4.0~6.5,Mn^(2+)浓度为0.05~0.15 mmol/L时对NtBGAL酶活性有增强作用。【结论】研究明确NtBGAL基因的组织表达模式及蛋白表征,为进一步通过改造NtBGAL基因,利用普通烟草生产人源化糖蛋白奠定基础。

β-半乳糖苷酶荧光探针的研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶,在食品工业、基因工程、酶工程、蛋白质工程、生物医学等领域发挥着重要作用。β-半乳糖苷酶活性及含量的异常与癌症的发生发展密切相关,因此该酶检测对早期癌症诊断有着重要意义。传统酶活性检测方法具有一定的局限性,无法实现对β-半乳糖苷酶的原位无损检测。荧光探针因灵敏度高、选择性好、可用显微镜直接观察、分辨率高、响应时间短、操作方便、成本低等优点深受研究者青睐。在简述荧光探针设计原理的基础上,对近年来β-半乳糖苷酶荧光探针的设计合成研究进展进行了综述,阐述了β-半乳糖苷酶荧光探针在生物成像、早期癌症诊断等应用进展,为β-半乳糖苷酶高效检测技术的研究提供了帮助。

日粮添加α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪生长性能、养分消化率及血清免疫指标的影响

本试验将不同水平的α-半乳糖苷酶添加到断奶苏姜仔猪日粮中,研究对其生长性能、血清免疫指标和养分消化率的影响。试验将108只断奶苏姜仔猪平均分为4组,每组3个重复,每个重复9只仔猪,分别为对照组(喂养普通日粮)、试验Ι组(日粮+50U/kgα-半乳糖苷酶)、试验Ⅱ组(日粮+100U/kgα-半乳糖苷酶)、试验Ⅲ组(日粮+200U/kgα-半乳糖苷酶),试验期为40d。结果发现:与对照组相比,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪的末重、平均日增重及料重比均有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶对提高断奶苏姜仔猪的生长性能效果最显著(P<0.05),断奶苏姜仔猪平均日增重比对照组提高了9.07%,料重比较对照组降低了8.82%;其次,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪血清中的IgA、IgG、IgM等免疫指标均有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶的试验组免疫指标与对照组相比差异最显著(P<0.05),IgA、IgG、IgM分别提高16.5%、21.6%和52.9%。最后,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶,对断奶苏姜仔猪的养分消化率也有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶的试验组养分消化率与对照组相比差异最显著(P<0.05),粗纤维消化率和粗蛋白质消化率分别比对照组提高8.29%和8.02%。结果表明,在日粮中添加100U/kg的α-半乳糖苷酶,对断奶苏姜仔猪的生长促进效果最明显,可使断奶苏姜仔猪的饲料效率最佳。

骨关节炎软骨中衰老相关β-半乳糖苷酶和c-Fos蛋白的表达

背景:文献在对软骨细胞衰老的研究中,常以衰老相关β-半乳糖苷酶的表达作为其细胞老化的一个指标,而c-Fos在骨关节炎软骨中表达情况罕见报道。目的:观察β-半乳糖苷酶、c-Fos蛋白在正常关节软骨和骨关节炎不同退变程度关节软骨中表达水平的差异。方法:选取正常关节软骨标本10个,骨关节炎软骨标本26个,根据大体观察凿取正常和骨关节炎不同退变严重程度软骨块50个,再根据关节软骨改良Mankin病理评分法分为正常关节软骨组、轻度退变组、中度退变组、重度退变组。采用免疫组织化学SABC法,计算各组标本中软骨细胞β-半乳糖苷酶、c-Fos蛋白染色阳性细胞率,比较各组中二者阳性细胞率的差异性并分析其与关节软骨不同退变程度之间的相关性。结果与结论:随着衰老软骨细胞阳性率逐渐增加,软骨退变程度逐渐加重,提示软骨细胞衰老与骨关节炎病程进展有关,软骨细胞衰老是骨关节炎可能的发病机制之一。c-Fos蛋白与骨关节炎软骨退变严重程度和软骨细胞衰老均无直接相关性,但可能在软骨退变早中期促进软骨细胞代偿性分裂增殖活跃。

衰老标记蛋白-30和β-半乳糖苷酶的表达与晶状体上皮细胞凋亡相关性研究

目的探讨衰老标记蛋白-30和与衰老相关的β-半乳糖苷酶在老年性白内障患者的晶状体上皮细胞凋亡表达的相关性。方法 248例年龄相关性白内障患者(其中126例皮质性白内障154只眼,122例核性白内障有142眼),对每个患者进行晶状体前囊中心部的环形撕囊。TUNEL法观察晶状体上皮细胞凋亡,免疫组织化学染色和实时PCR检测蛋白与mRNA的表达水平。分析衰老标记蛋白-30和β-半乳糖苷酶蛋白表达水平与晶状体上皮细胞凋亡的关系。结果衰老标记蛋白-30在晶状体前囊中心部比晶状体前囊周边有较低的蛋白表达水平,而衰老相关的β-半乳糖苷酶的表达在中央部分明显高于周边部分。与核性白内障患者相比,皮质性白内障患者的衰老标志物蛋白-30和mRNA的表达水平降低了,而衰老相关的β-半乳糖苷酶的表达升高了。TUNEL检测结果显示,两组晶状体上皮细胞的前囊中心部凋亡率明显高于周围部分。在晶状体前囊区中心或周围,皮质性白内障比核性白内障晶状体上皮细胞凋亡明显增高。结论在核性白内障和皮质性白内障,衰老标记蛋白-30和衰老相关的β-半乳糖苷酶的表达均与晶状体上皮细胞的凋亡有相关性。

大肠癌组织中β-半乳糖苷结合蛋白-3与β-葡萄糖醛酸苷酶表达的意义

目的:通过观察β-半乳糖苷结合蛋白-3(Galectin-3)与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-G)在大肠癌组织中的表达,与大肠癌的生物学特征进行比较,以探讨其临床意义.方法:采用SP免疫组织化学方法检测98例临床新鲜标本,其中包括15例癌旁正常大肠黏膜组织及83例大肠癌组织中galectin-3和β-G的表达情况,并进行两种蛋白的表达相关性分析.结果:Galectin-3和β-G蛋白在浸润程度深、分化程度低及Dukes分期较晚的大肠癌组织中的表达高于浸润程度浅(0.15±0.03 vs 0.16±0.05,P=0.02)、分化程度高(0.15±0.012 vs 0.16±0.03,P=0.03)及Dukes分期较早(0.18±0.06 vs 0.17±0.05)的大肠癌组织(P<0.05);在大肠癌组织中,ga-lectin-3的表达和β-G的表达呈正相关(r=0.628,P<0.01).结论:Galectin-3和β-G的异常表达在大肠癌的发生、发展中起着重要作用,具有一定的诊断价值.

利用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体

目的:采用一种简单易行的纯化方法获得高纯度α-半乳糖苷酶单克隆抗体。方法:使用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶捕获和纯化小鼠腹水中的α-半乳糖苷酶单克隆抗体。结果:获得了高纯度、高效价的α-半乳糖苷酶单克隆抗体。结论:应用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体是一种简单、有效的方法。

检测β-半乳糖苷酶荧光探针的研究进展

β-半乳糖苷酶(β-Gal)是重要的水解酶之一,与多种疾病的发生发展有关,是细胞衰老的重要生物标志物,生物体中β-Gal的荧光成像对于生物学研究具有重要意义。近年来,荧光探针因其光毒性低、生物分子自发荧光干扰小、光散射低、组织穿透能力强、稳定性好,可以实现活体动物肿瘤组织成像等优点成为检测体内小分子物质的新型手段。如今已发展了大量的识别生物体系内β-Gal的荧光探针,这些探针可以可视化的监测体内β-Gal的生物活性。本文对目前检测β-Gal的荧光探针的研究进展进行了综述,对将来β-Gal识别荧光探针的研究方向进行了展望。

荧光传导机理构建β-半乳糖苷酶探针的研究进展

半乳糖苷酶(β-Gal)是细胞溶酶体中的一种糖苷水解酶,在催化糖苷键水解以及维持正常生命活动等领域起着至关重要的作用。开发能精确、快速检测β-Gal活性的方法对于卵巢癌、细胞衰老引发疾病的早期诊断和分子生物学领域的研究是十分重要的。考虑到荧光探针具有检测灵敏、响应迅速和时空分辨率高等特性,该综述对近年来报道的β-Gal荧光探针研究进展及其疾病诊断效果进行了总结,介绍了依据分子内电荷转移、荧光共振能量转移、聚集诱导发光和光诱导电子转移等信号传导机理构建β-Gal荧光探针的分子设计策略及应用特点,并重点介绍了二维检测体系能够突破探针使用单一信号传导机理进行检测时常遇到的局限。指出合理应用荧光信号传导机理构建具有灵敏性、空间分辨率高,化学稳定性好和细胞蓄积能力强等特点的β-Gal荧光探针,能够推进β-Gal荧光探针在卵巢癌诊断及治疗效果评价,细胞衰老程度评估和个体健康寿命预测等生物领域的高效应用。

Fabry病的临床、病理和α-半乳糖苷酶A活性研究

目的分析我国4个Fabry病家族患者的临床表现和α-半乳糖苷酶A活性改变规律,探索脂质沉积物对血管内皮细胞血栓调节蛋白表达的影响。方法4个Fabry病家族的23例患者,发病年龄5～8岁,首发症状主要是发作性肢端疼痛,其中伴有血管角皮瘤4例,肾损害5例,伴有高血压病和胃肠道症状各3例。对4例先证者的腓肠神经标本进行组织学、超微组织学观察和血栓调节蛋白免疫组织化学染色,对2例先证者和5例发病的家庭成员测定血α-半乳糖苷酶A活性。结果4例先证者的腓肠神经小血管内皮细胞和平滑肌细胞以及神经束衣的成纤维细胞内出现大量致密嗜锇性颗粒。仅13%的血管出现血栓调节蛋白阳性表达,对照者80%的血管出现血栓调节蛋白阳性表达。男性患者的α-半乳糖苷酶A活性为正常对照者的12%,女性患者则为正常对照者的31%。结论血栓调节蛋白表达下降可能与血管内皮细胞脂质大量沉积有关并导致其抗凝功能下降,α-半乳糖苷酶A活性下降程度存在性别差异。

苦瓜果实β-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及亚细胞定位

根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的1个与β-Gal基因相关的EST序列,采用经3'RACE技术,克隆获得1个苦瓜β-Gal基因的cDNA序列McGAL,全长为2261 bp,开放阅读框2160 bp,编码719个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为AFD54987.1。应用生物信息学软件对McGAL氨基酸序列分析表明,McGAL含有糖苷水解酶家族35的保守结构域G-G-P-[LIVM]-x-Q-x-E-N-E-[FY],C端不含凝集素结构域。二级结构显示,该酶含有α-螺旋(19.89%)、伸展链(26.98%)、β-转角(6.54%)和无规卷曲(46.59%)。McGAL氨基酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、绿豆、大豆、羽扇豆的氨基酸序列的同源性分别达到73%、73%、73%、72%和71%。亚细胞定位结果表明,McGAL定位在线粒体膜上。荧光定量结果表明,McGAL在果实绿熟期表达量最高并随之下降,该基因可能与果实成熟软化初期相关。

酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

目的建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法。方法采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定最佳酶活测定条件。结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)>8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109中差异有统计学意义(P<0.001),而在Y187中没有明显差异(P>0.05)。结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定。

枣果实β-半乳糖苷酶基因的克隆及表达分析

采用3-′RACE技术获得了梨枣果实β-半乳糖苷酶(-βGal)基因的部分cDNA片段,并运用实时荧光定量PCR技术和PNPG反应比色法,研究了梨枣不同生长期及采后常温贮藏过程中ZJGAL基因的相对表达量和β-Gal活性的变化,以探索β-半乳糖苷酶在枣(Ziziphus jujubaMill.)果实生长及采后软化中的分子调控机制.结果表明,克隆的-βGal基因序列长2 584 bp(GenBank登录号HQ827769),其中包含2 193 bp的最大阅读框,编码730个氨基酸,将该基因命名为ZJGAL.Blastn和Blastp序列比对分析发现,该ZJGAL基因与已登录的其他物种的β-Gal基因相似性达到60%～80%.随着果实的生长、成熟及采后衰老,ZJGAL基因的表达量和-βGal活性在果实采收前后均呈先上升后下降的趋势,两者的采前高峰均在幼果膨大期,但是采后贮藏过程中虽然基因的表达量较高,但是-βGal活性一直较低.

非融合表达β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌的构建和性能研究

目的构建能非融合表达高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,并对其酶活性和分泌性能进行研究。方法提取能在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶的重组质粒pMG36e-lacZ1.1480和pMG36e-lacZwch9901,电转化乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363。测定重组菌在不同培养时间和乳糖浓度下的β-半乳糖苷酶活性,及在不同培养条件下的酶分泌率。结果携带pMG36e-lacZwch9901的重组乳酸乳球菌(MG1363/pMG36e-lacZ wch9901)具最高酶活性,其β-半乳糖苷酶活性达(16.95±0.09)U/mgpro,为基因初始菌的2.75倍;重组乳酸乳球菌培养24h产酶达高峰;培养基含乳糖时,重组菌酶活测定结果表现为降低;重组乳酸乳球菌表达的β-半乳糖苷酶可分泌到培养基中,当培养基不含红霉素,而含20g/L乳糖时,分泌率最高,达(27.09±0.05)%。结论获得了能非融合表达和分泌高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,可在此基础上进一步研制β-半乳糖苷酶活菌释放体。

重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究

α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80～150U/mL,蛋白浓度为3～4.5mg/mL,比活性约为20～30U/mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98%以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。

人参、三七、川芎提取物对血管平滑肌细胞衰老相关β半乳糖苷酶及p16-cyclinD/CDK-Rb通路的影响

目的:观察人参、三七、川芎提取物延缓自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)衰老的作用及其可能的细胞周期调控机制。方法:取大鼠胸主动脉用于分离VMSC,采用原代细胞培养的方法建立SHR大鼠VMSC模型,实验分为Wistar-Kyoto(WKY)大鼠对照组、SHR模型组、缬沙坦组、中药低剂量组和中药高剂量组。采用衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色法观察细胞衰老情况,流式细胞仪分析细胞周期分布,逆转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹法检测各组细胞p16、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase4,CDK4)和成视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)的表达。结果:SA-β-gal染色显示,与WKY组比较,SHR组SA-β-gal阳性细胞数明显增多(P<0.01),人参、三七、川芎提取物可使SHR VSMC SA-β-gal阳性细胞数明显减少(P<0.01);流式细胞仪检测显示,与WKY组比较,SHR组VSMC在G1期明显减少,S期细胞明显增加,中药干预后SHR的VSMC G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少(P<0.05);实时荧光定量聚合酶链式反应检测显示,与WKY组比较,SHR组VSMC的p16和Rb mRNA表达量明显减少,cyclin D1和CDK4mRNA表达增加;人参、三七、川芎提取物干预后SHR VSMC p16和Rb mRNA表达量增加,cyclin D1和CDK4mRNA减少。蛋白质印迹法显示,与WKY组比较,SHR组VSMC的p16蛋白表达量明显减少,cyclin D1、CDK4和磷酸化Rb蛋白表达量明显增加(P<0.05);中药干预后SHR VSMC p16蛋白表达增加,cyclin D1、CDK4和磷酸化Rb蛋白表达量减少(P<0.05)。结论:人参、三七、川芎提取物通过改变p16-cyclin D/CDK-Rb通路因子的表达而发挥延缓SHR VSMC衰老的作用。

赤豆β-半乳糖苷酶固定化及其性质研究

用阳离子修饰的 Sephadex G- 1 0 0 ,经 Br CN活化 ,将部分纯化的赤豆 β-半乳糖苷酶通过吸附和共价交联法固定化。固定化载体表现出较高的蛋白载量和酶活性收率。固定化酶活性收率达 6 5 %。动力学性质研究表明 ,固定化酶酸碱稳定性、热稳定性、存储稳定性和使用稳定性都比游离酶好。

黄瓜α-半乳糖苷酶-EGFP融合表达载体的构建

[目的]构建由CaMV 35S启动子调控的黄瓜α-半乳糖苷酶的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green flurescent protein,EGFP)融合表达载体。[方法]运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,分别以质粒pCambia 1303和pEGFP-N1为模板扩增CaMV35S启动子序列和EGFP编码序列;运用反转录聚合酶链式反应(Reverse transcript-PCR,RT-PCR)技术,以黄瓜总RNA为模板扩增黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ编码序列;将上述3个片段插入表达载体pCambia 1381*c的多克隆位点,构建EGFP位于目的基因C端的α-半乳糖苷酶基因的EGFP融合表达载体。[结果]经酶切、测序等验证,黄瓜α-半乳糖苷酶-EGFP融合表达载体构建成功。[结论]为进一步研究黄瓜α-半乳糖苷酶的亚细胞定位奠定基础。

TAT-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性的研究

为寻找介导外源蛋白质进入组织细胞的生物学方法 ,本研究构建了pET2 8a TAT LacZ重组表达子 ,纯化得到TAT β Gal融合蛋白 ,通过腹腔注射到小鼠体内观察TAT β Gal能否穿过各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。结果发现TAT β Gal在短时间内可到达各组织。该研究证明在生物大分子的N 末端加上TAT具有穿透力的蛋白转导区肽段形成的融合蛋白可穿过生物膜到达各组织 ,这一发现为肽类。

α-半乳糖苷酶在家禽日粮中的应用

α-半乳糖苷酶属于外切糖苷酶类,能专一性催化水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端的α-1,6半乳糖苷键。它不仅能水解棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖,还能水解含α-半乳糖苷的杂多糖。近年来的研究表明,该酶作为一种特异性外源酶,