应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒的实验研究

摘要：目的应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）基因重组腺病毒。方法将β-gal基因克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack—CMV上，在BJ5183大肠杆菌内与pAdEasyl骨架质粒完成同源重组；经脂质体介导转入HEK293细胞包装、扩增并经反复乒乓感染获得携带β-gal基因的重组腺病毒Ad—β-gal；有限稀释法检测病毒滴度；X—gal组织化学染色检测重组腺病毒Ad—β-gal在HEK293细胞中的功能。结果成功构建携带β-gal基因的重组腺病毒Ad—β-gal，病毒滴度达（2．5～4．0）×10^11EFU／ml；感染复数（multiplicity of infection，MOI）为10时对HEK293细胞48h转染率达70％，并在X—gal试剂作用下，细胞呈现蓝色。结论成功构建了携带β-gal基因的重组腺病毒，能高效感染293细胞，并功能性表达β-半乳糖苷酶。

根癌农杆菌介导β-1,4-半乳糖苷转移酶基因转化大豆及其转基因植株再生

以大豆下胚轴为外植体 ,通过根癌农杆菌介导转化法 ,建立起良好的转化系统 ,将人的 β -1 ,4-半乳糖苷转移酶基因 (hGT)导入大豆。经转化的外植体在添加 1 0 0mg/L氨苄青霉素和 5 0mg/L卡那霉素的选择培养基中可诱导出愈伤组织和芽再生 ,在 1 /2MS培养基上诱导生根 ,并培养成再生苗 ,获得了完整的抗性再生植株。进行Southernblot分子杂交鉴定 。

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。

重组β-半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 :构建表达 β -半乳糖苷酶 (β -gal)的重组腺病毒 ,以期为再狭窄的基因治疗研究提供一个对照载体和为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、转染效率的研究提供一有用的工具。方法 :采用基因重组方法构建穿梭质粒pAd - β -gal,通过同源重组法制备出重组腺病毒Ad - β -gal,转染的 2 93细胞用X -gal染色鉴定Ad - β-gal的正确与否。通过测定 2 6 0nm的紫外光吸收值估计病毒高度。原代大鼠血管平滑肌细胞采用组织块培养法。Ad - β -gal以 10 0moi感染VSMCs并行X -gal染色 ,以观察 β -gal在VSMCs中的表达情况。 结果 :成功构建了pAd - β -gal穿梭质粒和Ad - β -gal重组腺病毒 ,转染的 2 93细胞和VSMCs经X -gal染为蓝色 ,病毒浓度为 9× 10 11pfu/ml,以 10 0moiAd - β-gal转染VSMCs,其转染效率接近 10 0 %。结论 :表达 β -gal的重组腺病毒构建成功 ,并在VSMCs中得到有效表达 ,本研究为将来再狭窄基因治疗研究提供了一对照载体 ,也为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、有效性的研究提供了一有用的工具。

冠脉内导入重组β-半乳糖苷酶腺病毒的实验研究

目的 :研究经冠状动脉内导入重组 β-gal腺病毒后心肌的转染效率 ,证明冠脉内导入途径是否为重组基因导入心脏的有效的可行的途径。方法 :用定向克隆的方法构建重组 β -gal腺病毒载体 ,将 1 .53× 1 0 1 2 pfu重组 β-gal腺病毒经冠状动脉造影导管由左冠状动脉分别导入到 7只雄性Yorkshire猪心脏中 ,于术后 1周、2周、4周及 8周处死动物 ,取左右冠状动脉、3～ 5mm厚的不同部位的心肌及各实质脏器标本 ,经 1 .2 5 %戊二醛固定 2 0min ,用PBS洗涤 3次 ,在室温下用X -gal染液染色 1 6～ 2 4h ,脱水、石蜡包埋、切片及HE复染 ,光镜下计算出表达 β -gal的心肌细胞百分数即为转染效率。结果 :经冠状动脉内导入重组基因后 ,于术后 1周即有 β-gal表达 ,2周达高峰 ,心肌细胞的转染效率高达 45 .57% ,全层左冠状动脉壁、心肌间质中均有 β-gal表达 ,4周 β-gal表达下降 ,8周 β -gal恢复至对照组的基线水平。结论 :经冠状动脉内导入重组腺病毒 ,心肌细胞及冠脉壁重组基因表达效率高 。

体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒,回收4.6 kb的LacZ基因表达盒,与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接,连接产物用SwaⅠ酶切,最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后,用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsC l密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312 bp特异性条带,PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Ad-eno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法,本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础,Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。

α-1,3-半乳糖苷转移酶基因沉默小鼠的建立初探

目的获得转α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因的小鼠。方法将α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因用显微注射的方法导入小鼠受精卵。结果移植注射胚853枚,其中移植312枚1-细胞胚于11只受体鼠,6只受孕(54.5%)均中途流产(解剖发现子宫角明显增粗、充血、残骸);移植注射胚541枚2-细胞胚于23只受体鼠,18只受孕(78.3%),11只受孕均中途流产了,3只足日剖宫产获14只死胎,平均体重2.14g,未检测到阳性;4只12日龄左右剖宫获21只残骸有7只阳性。结论通过显微注射的方法,α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因可以整合,但要得到整合成活个体还有待进一步研究。

β-半乳糖苷酶基因在小鼠乳腺细胞表达的研究

构建了以乳清酸蛋白（ＷＡＰ）５′区２．６ｋｂ为调控序列，指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒，采用直接注射质粒于乳腺的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性，证实ＷＡＰ基因调控序列的功能正确性，可以用于转基因动物乳腺表达研究，同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．

不同来源α-半乳糖苷酶对肉仔鸡生产性能及血液生化指标的影响

试验旨在研究微生物和转基因玉米两种来源的α-半乳糖苷酶对肉仔鸡生产性能以及血液理化指标的影响。选取648只1日龄AA肉仔鸡随机分为3组,每组12个重复,每个重复18只(公母各半)。1组饲喂添加90 U/kg微生物来源α-半乳糖苷酶的饲粮,2组饲喂α-半乳糖苷酶转基因玉米(酶活150 U/kg)替代50%亲本玉米,3组饲喂α-半乳糖苷酶转基因玉米替代100%亲本玉米的饲粮,试验期为6周。结果显示:各组间肉鸡日增重、采食量差异不显著(P>0.05),2组饲料报酬优于1组;2组和3组粪便中的棉籽糖、水苏糖含量显著低于1组(P<0.05);各组间肉鸡血液生化指标无显著区别。试验表明转基因玉米来源的α-半乳糖苷酶在改善肉鸡饲料报酬、降低粪便中棉籽糖和水苏糖含量效果优于微生物源α-半乳糖苷酶。

β-半乳糖苷酶在ROSAβgeo26小鼠衍生的神经干细胞中的表达变化

目的观察β-半乳糖苷酶(β-gal)在ROSAβgeo26小鼠衍生的神经干细胞(NSCs)中的表达变化。方法体外培养NSCs,并应用X-Gal组织化学和免疫细胞化学染色技术研究NSCs中β-gal的表达变化。结果原代克隆球和亚克隆球的NSCs均稳定表达β-gal;在NSCs分化过程中,NeuN阳性的神经元、GalC阳性的少突胶质细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞均表达β-gal,但表达水平有所下降。结论ROSAβgeo26小鼠衍生的NSCs能稳定的表达β-gal,可用作NSCs研究的细胞来源。但在干细胞分化的相关研究中,值得注意存在β-gal不同程度的表达下调现象,并应进一步关注出现该现象的潜在机制。

腺病毒载体介导的人类α1-抗胰蛋白酶过表达可促进伤口愈合

目的α1-抗胰蛋白酶(ATT)是一种存在于血浆与伤口处的丝氨酸蛋白酶抑制剂,本实验目的是研究ATT在伤口愈合过程中的重要作用。方法构建α1-抗胰蛋白酶转基因腺病毒(Ad-ATT)表达模型,并阐述其生物学功能。结果(1)在正常鼠实验中,与对照组LacZ(β-半乳糖苷酶)相比,过表达的ATT能够促进肉芽组织形成、胶原蛋白沉积和细胞增生;(2)正常鼠与(链脲霉素诱发的)糖尿病鼠对比实验中,Ad-ATT能明显增强伤口的弹性强度;(3)经药物诱发老鼠出现慢性伤口的实验模型中,组织学分析显示,伤口处注射Ad-ATT后炎性细胞浸润比注射Ad-LacZ明显减少。结论数据显示过表达的Ad-ATT通过降低炎症反应程度的方式促进伤口愈合。

腺病毒介导基因转染活体眼组织的研究

目的 :了解活体内不同途径应用腺病毒转染外源基因在眼组织的分布情况 .方法 :将含有 β 半乳糖苷酶 (beta galactosidase,β gal)报告基因的腺病毒 ,在 1× 10 9～ 1× 10 11nfu·L-1的滴度下 ,分别采用玻璃体腔内注射、前房注射、表面点药及球旁注射到大鼠眼内 ,3d ,1,2 ,3和 4wk后用 β gal染色法观察 β gal基因在眼组织内的分布情况 .结果 :各病毒滴度组均可有效地转染外源基因 ,且未观察到细胞病理改变 .玻璃体腔内注射的大鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜均有β gal基因表达 ,前房注射组角膜、虹膜、睫状体有表达 ,表面点药组仅有角膜上皮细胞表达 ,球旁注射组眼外肌有表达 .注射 3d后开始出现 β gal基因阳性表达 ,持续达 4wk以上 .结论 :腺病毒能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体。

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β半乳糖苷酶基因。方法从人二倍体细胞Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８８８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲⅠ酶切Ａｄ７ｖＤＮＡ共转染２９３细胞，获得表达β半乳糖苷酶重组病毒。结果构建了缺失部分Ｅ３区Ａｄ７ｖ载体，在ＣＭＶ启动子的作用下该载体能有效地表达外源基因。

将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性。方法将携带半乳糖苷酶报告基因(LacZ)的5型重组腺病毒载体(Ad5 CMVLacZ)注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3 d、7 d、14 d、21 d及28 d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶(β-gal)免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物。结果β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28 d之久。结论经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功。

4型腺病毒载体的构建和β－半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段（７０．５－８３．０基因图谱单位）克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４（７０．５－８３）质粒，质粒ｐＡｄ４（７０．５－８３）和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂＰ腺病毒晚期表达盒，在所构建的腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ３区编码分子量为１９３００糖蛋白基因的３种Ａｄ４载体。将ｌａｃＺ基因插入载体表达区，与Ｂｅｌｌ消化的Ａｄ４ＤＮＡＡ片段共转染Ａ５４９细胞，ＯＮＰＧ法检测证实所构建的载体和表达盒功能良好。本项工作对于在国内研究口服活疫苗及开展基因治疗均具有重要意义。

提高腺病毒表达载体扩增效率的研究

目的探讨在体外扩增重组腺病毒表达载体的有效方法。方法用含10%胎牛血清RPMI1640培养液常规培养人胚肾293细胞,当细胞生长至70%～80%汇合时,加入含有报告基因LacZ的重组5型腺病毒载体(Ad5CMVLacZ)共同培养36～38h。用X-gal组织化学方法检测Ad5CMVLacZ转染和表达的程度。结果293细胞生长至70%～80%汇合时,分裂增殖旺盛,形态为梭形、多角形,有明显分裂相,为指数生长期细胞。加入Ad5CMVLacZ8h后,293细胞开始出现肿胀,细胞间联系疏松,36～48h后细胞变成圆形、球形,对光折射增强,并聚集成葡萄串状。在此时间段作X-gal组化反应显示,约90%的293细胞被转染和表达产物。结论用上述方法可提高体外扩增腺病毒载体的效率,只要把握好病毒转染的时机和收获被转染293细胞的时机,就有可能制备出高滴度的病毒液,从而满足基因治疗神经退行性疾病的需要。

转基因克隆猪与人类异种器官移植

利用猪的器官来解决当前人源器官严重短缺 ,为解决移植器官短缺的可行的途径 ,直接并准确地对α- 1,3半乳糖苷转移酶 (α - 1,3GT)基因进行同源重组 ,使α- 1,3GT失活 ,再结合猪体细胞克隆技术 ,对其进行人源化改造 ,减弱或消除排异反应。然而 ,猪内源性逆转录病毒 (porcineendogenousretrovirus,PERV)为异种器官移植的主要障碍。因此 ,既要剔除导致人类排异反应的排斥基因 。

复制缺陷重组腺病毒有效转染兔心包组织的实验研究

目的 观察腺病毒载体转染兔心包组织的有效性和外源性基因表达的时相性。方法 用第五代腺病毒粘粒(Adv5-CAG)为对照组或含β半乳糖苷酶基因的第五代腺病毒质粒(Adv5-CAG/LacZ)为实验组转染兔心包组织,转染后第3、7、14、28 d取被转染组织行β-半乳糖苷酶(X-gal)染色及β半乳糖苷酶活性检测。结果 X-gal染色显示实验组转染后第3、7、14、28 d注射部位心包组织均见蓝染,尤以第7 d最明显,而对照组心包组织均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示实验组转染后第3 d心包组织中即有β-半乳糖苷酶表达,7、14 d达高峰,28 d表达量明显减少。结论 重组腺病毒载体可有效地转染兔心包组织,外源性基因在兔心包组织中能够表达并能维持1个月左右。

澳新拟批准一种来自转基因枯草芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶作为加工助剂

据澳新食品标准局(FSANZ)消息,2021年1月13日,澳新食品标准局发布146-21号通知,其中A1218号申请,申请将来自转基因枯草芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)作为加工助剂。据通知,该β-半乳糖苷酶用于乳制品的加工生产中。

采用高分子介导精子作载体制备转基因泥鳅

为探讨树形高分子介导精子载体技术产生转基因动物 ,将泥鳅精子与具有标记基因LacZ的pCH1 1 0重组质粒和树形高分子在保存液内孵育 ,经DNA原位杂交检测发现树形高分子介导下精子携带外源DNA的效率得到较大的提高。将捕获了外源DNA的精子 ,再与泥鳅卵进行体外人工受精。由此发育的鱼苗经PCR和LacZ组织化学检测 ,获得了高比例的转基因泥鳅 。