异黄酮与β-伴大豆球蛋白的相互作用及其对蛋白结构和潜在致敏性的影响

探究异黄酮和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin,BCG)的相互作用机理及其对复合物结构和潜在致敏性的影响。利用荧光光谱、圆二色光谱分析2种大豆异黄酮(染料木素(genistein,Gen)、大豆苷元(daidzein,Dai))与BCG相互作用的猝灭类型、结合位点数、作用力类型和蛋白二级结构含量的变化,表征不同条件下制备的异黄酮-BCG复合物的结构,并利用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)与消化产物免疫印迹检测其潜在致敏性。结果表明:活性异黄酮(Gen/Dai)对BCG的猝灭为静态猝灭,且相互作用力以疏水相互作用为主,结合位点数均接近1;并且与异黄酮相互作用诱导了BCG氨基酸微环境的极性增加,使蛋白肽链伸展,结构更为松散;ELISA与消化产物免疫印迹结果显示,与异黄酮结合后蛋白的潜在致敏性增强。本研究有助于科学认识异黄酮在食品复杂基质体系中对过敏蛋白致敏性影响机制,对其抗过敏的深度开发利用具有重要意义。

β-伴大豆球蛋白诱导杂交黄颡鱼肠道上皮细胞内质网应激模型的建立

实验旨在利用β-伴大豆球蛋白构建黄颡鱼上皮细胞内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)模型。利用酶消化法分离得到黄颡鱼肠道上皮细胞,通过细胞形态、角蛋白18(Cytokeratin-18,CK-18)免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色法鉴定。利用不同浓度β-伴大豆球蛋白刺激24h后,RT-qPCR检测相关基因转录表达水平,筛选最合适刺激浓度。在此浓度下分别刺激黄颡鱼肠道上皮细胞0、12h、24h和36h,使用RTqPCR、CCK8、透射电镜和免疫荧光染色等方法检测相关指标,筛选最适刺激时间。结果表明:(1)成功分离培养黄颡鱼肠道上皮细胞,细胞呈铺路石状,CK-18和碱性磷酸酶染色呈阳性;(2)成功筛选到4 mg/mLβ-伴大豆球蛋白为最佳刺激浓度。在该浓度下,除grp78、jnk、il-10、atf6外,内质网应激、自噬、凋亡、炎症等相关基因表达水平均显著最高(P<0.05);成功筛选24h为最适刺激时间。4 mg/mL β-伴大豆球蛋白刺激细胞24h显著降低细胞活力,同时引起内质网显著肿胀,GRP78、LC3、Caspase3蛋白表达和Tunel信号显著升高(P<0.01),perk、atf6、beclin1、lc3a、bcl2、caspase3、caspase9和il-12 mRNA表达水平显著最高(P<0.05)。综上,实验成功分离得到黄颡鱼肠道上皮细胞,构建了黄颡鱼肠道上皮细胞内质网应激模型。实验为进一步研究未折叠反应信号通路在黄颡鱼豆粕诱导肠炎发生发展中的作用奠定基础。

透明质酸-大豆β-伴球蛋白复合膜对鲢鱼片微冻贮藏品质影响

为解决淡水鱼在贮藏过程中蛋白质氧化及品质劣变问题,采用0.9%透明质酸(hyaluronic acid,HA)分别与1%、2%、3%大豆β-伴球蛋白制备复合涂膜剂处理鲢鱼肉,在-3℃微冻贮藏28 d,考察鲢鱼肉贮藏期的持水力、色差(△E)、pH值、电导率、挥发性盐基氮(total volatile basicnitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric reactive subs-tances,TBARS)、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)可溶性肽含量的变化,探究鱼肉肌原纤维蛋白氧化规律,结合主成分分析(principal component analysis,PCA)研究涂膜及微冻技术对鲢鱼肉蛋白质氧化及品质的控制作用。结果表明:与未经涂膜鲢鱼肉相比,复合涂膜可以延缓鲢鱼肉TVB-N、TBARS、pH值、电导率、TCA可溶性肽含量的升高,抑制鱼肉持水力、△E的下降。经复合涂膜处理,鱼肉肌原纤维蛋白巯基含量及钙离子ATP酶(calcium-ATPase,Ca^(2+)-ATPase)的活性提高,羰基含量和表面疏水性明显降低。主成分分析提取的2个主成分的累计方差贡献率达到86.782%,能较好地反映原始信息,可直观了解到各涂膜处理鲢鱼肉品质变化趋势。综合评定,0.9%HA-2%大豆β-伴球蛋白涂膜鱼肉的保鲜效果最佳。

2种黑豆球蛋白与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相互作用研究

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)在不同pH值环境中的主要存在形式不同,其抗氧化能力也有所差异。黑豆蛋白是一种常见的膳食蛋白,具有作为不稳定生物活性化合物载体的潜力,了解黑豆球蛋白与C3G的相互作用机制有利于它们在食品体系中的应用。通过多种光谱学分析和分子对接实验研究了pH值为2.0、5.0和7.0时黑豆β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)与C3G的相互作用及其对C3G氧化稳定性和抗氧化能力的影响。研究结果表明,pH值为2.0和5.0时,C3G与7S和11S结合不仅导致Tyr残基周围的疏水环境减少,极性增加,而且使7S和11S中α-螺旋增加,β-折叠比例下降。pH值为7.0时,C3G的存在使7S和11S中α-螺旋和β-折叠的占比呈增加趋势,但β-转角比例降低。此外,C3G与7S和11S结合是一个放热过程,在不同pH值条件下,C3G与7S和11S主要通过氢键和范德华力相互作用使7S和11S静态荧光猝灭。7S和11S均在pH值为7.0时对C3G亲和力最强。分子对接结果表明,7S上的GLU229、ARG356和PRO101残基,11S上的ARG161、VAL162、ILE171和THR176残基在与C3G结合中起关键作用。在不同pH值条件下,7S、11S与C3G结合后均显著增强了C3G的氧化稳定性和抗氧化能力。

糖基化β-伴大豆球蛋白负载提高姜黄素抗氧化及缓释特性

利用干法糖基化制备β-伴大豆球蛋白(soyβ-conglycinin,7S)-葡聚糖共价接枝物包埋姜黄素,并研究姜黄素的抗氧化及缓释效果。结果表明,随着反应时间(0、24、48、72 h)延长,7S-葡聚糖共价复合物接枝度和褐变度逐渐增加,至72 h达到最高,分别为15.02%和0.24。通过pH值循环法诱导7S、7S-葡聚糖封装姜黄素,形成7S-姜黄素、7S-葡聚糖-姜黄素纳米复合物,发现反应时间为72 h时,7S-葡聚糖表现出最高的姜黄素负载量(129.61μg/mg),显著高于7S(69.06μg/mg)。荧光光谱分析表明姜黄素主要通过疏水相互作用与7S、7S-葡聚糖-72 h结合。透射电子显微镜观察到7S-姜黄素和7S-葡聚糖-72 h-姜黄素纳米复合物为球形。姜黄素质量浓度为100μg/mL时,与游离的姜黄素相比,封装在7S-葡聚糖-72 h内的姜黄素抗氧化能力提高1.36倍,且表现出稳定的缓释性能。7S-葡聚糖-72 h负载的姜黄素生物可利用率为66.83%,而7S负载的姜黄素和游离姜黄素生物可利用率分别为48.93%和33.06%。研究结果表明7S-葡聚糖-72 h可作为良好的姜黄素纳米载体,改善其抗氧化及缓释能力。

β-伴大豆球蛋白天然活性亚基的分离纯化

本研究将离子交换层析和金属螯合亲和层析方法相结合,建立了系统的分离纯化β-伴大豆球蛋白天然状态亚基的方法,通过梯度脲透析复性,使纯化亚基恢复天然构象。利用β-伴大豆球蛋白免疫动物制备抗血清对纯化亚基的免疫活性进行检测。结果表明:离子交换层析结合金属螯合亲和层析方法可以有效地纯化β-伴大豆球蛋白的α、α'和β亚基,该方法产率高,制备的亚基纯度好,而且能与抗β伴大豆球蛋白血清特异性结合,表明提纯的亚基具有免疫活性。

β-伴大豆球蛋白对仔猪抗营养阈值的研究进展

β-伴大豆球蛋白等抗原蛋白热稳定性较强,其抗原活性难以完全去除,可导致仔猪等幼龄动物产生过敏反应,从而影响其生理健康、日粮养分消化利用和生产性能。目前针对不同大豆制品在畜禽生产中的应用已有大量研究,但大豆抗原蛋白在幼龄畜禽日粮中的安全剂量尚不明确。本文对β-伴大豆球蛋白的理化性质及对仔猪的致敏机制、大豆制品中β-伴大豆球蛋白含量及大豆制品在仔猪生产中的应用进行综述,并对β-伴大豆球蛋白在仔猪日粮中的安全剂量进行探讨。

大豆7S球蛋白β-伴大豆球蛋白的研究现状

大豆β-伴大豆球蛋白约占大豆籽粒总蛋白含量的25%,是7S球蛋白的组分之一,是影响大豆籽粒蛋白营养品质及加工品质的重要组分。本文对大豆7S球蛋白β-伴大豆球蛋白的基本属性,亚基积累规律,遗传变异体的种类及其分子遗传学水平的研究现状等进行了综述。

植物乳酸菌发酵对大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白免疫活性及水解度的影响

本试验通过植物乳酸菌对豆粉进行液态发酵,在发酵24,36,48,60,72 h时采集发酵样品进行水解度和免疫活性的检测,结果表明:(1)48 h为植物乳酸菌发酵豆粉的最佳时间,可去除71.08%的β-伴大豆球蛋白和64.22%的大豆球蛋白的免疫活性(P<0.01),对β-伴大豆球蛋白的去除程度显著高于大豆球蛋白(P<0.01)。(2)乳酸菌发酵可显著提高豆粉中蛋白质的含量、水解度(P<0.01)以及体外消化率(P<0.01)。(3)蛋白质的水解度与大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白免疫活性之间存在强烈的负相关(P<0.01),与蛋白质的体外消化率存在正相关(P<0.01)。

β-伴大豆球蛋白β亚基的纯化及免疫活性鉴定

等电点沉淀法和凝胶过滤层析提纯的β-伴大豆球蛋白经6mol·L-1脲变性后解聚为游离亚基,利用DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换层析分离纯化β-伴大豆球蛋白亚基,并对纯化亚基进行透析复性。同时将β-伴大豆球蛋白免疫家兔制备抗血清,利用免疫印迹方法检测纯化的亚基与β-伴大豆球蛋白抗血清是否发生免疫反应。结果表明:利用DEAE琼脂糖凝胶FF阴离子交换层析可以纯化出高纯度的β-伴大豆球蛋白β亚基,纯化的β亚基可以与抗β-伴大豆球蛋白抗体结合,具有免疫活性。

蒸汽处理前后β-伴大豆球蛋白在仔猪消化道内免疫活性变化规律的研究

随机从2窝“杜长约”三元杂交仔猪中挑选12头,分成A、B、C3组,每组4个重复,公、母各半。21日龄断奶;22-26日龄,A组饲喂不舍任何豆科植物的代乳料,B、C组分别饲喂合纯化的蒸汽处理前、后β-伴大豆球蛋白的代乳料。26日龄全部屠宰,取胃、空肠中段、盲肠和结肠中的食糜,以测定消化道各部位β-伴大豆球蛋白的免疫活性。结果表明:随着消化道的延续,β-伴大豆球蛋白的免疫活性均呈下降趋势;与消化道其他部位比较起来,活性在胃和空肠下降幅度较大,到空肠中段基本丧失,从空肠中段到结肠无明显变化;整个消化道中,采食含未经蒸汽处理β-伴大豆球蛋白代乳料仔猪中β-伴大豆球蛋白免疫活性的下降幅度均小于采食含蒸汽处理β-伴大豆球蛋白代乳料的仔猪。

大豆β-伴大豆球蛋白研究进展

在大豆抗原蛋白的研究中,β-伴大豆球蛋白的研究比较重要。在其结构和特性方面,β-伴大豆球蛋白的α′亚基和该亚基上的Soymetide研究较为深入,并且摄入β-伴大豆球蛋白与体内甘油三酯含量有一定关系。很多研究表明,仔猪腹泻、犊牛腹泻的主要诱因来自于抗原性蛋白所引起的体内消化道免疫反应。不同的加工工艺如挤压膨化、乙醇浸提,可以降低β-伴大豆球蛋白对于机体的损害,本文还基于现在的研究提出了进一步的展望。

分离β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白工艺研究

采用大容量(250×4mL)低速(5300×g)离心机分离β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白,进行碱溶条件、酸沉条件等条件的研究。结果表明:提取蛋白的碱性溶液(pH8.5的Tris-HCl溶液)离心效果较佳,沉淀大豆球蛋白pH6.4为佳,沉淀β-伴大豆球蛋白pH4.8为佳,用pH5.0沉淀杂蛋白离心分离效果较好;每一个待离心的浊液,在离心之前4℃冷藏2h以上,对离心效果的提高十分有效;采用最佳条件,从300g脱脂豆片分离大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白,收率分别为6.8%和2.2%,用SDS-PAGE电泳实验方法测定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白样品纯度分别为89.1%和78.9%。因此该低速离心法较适合数十克级别的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的分离。

β-伴大豆球蛋白α′-亚基的基因克隆及原核表达

为制备N-连接糖基缺失的重组β-伴大豆球蛋白α′-亚基,以‘鲁96150’大豆种子为原料提取总RNA,经RT-PCR一步法获得‘鲁96150’大豆的全长cDNA,采用自行设计的引物F1/F2扩增得到目的基因α′,与pGEM-T easy载体相连构建重组克隆载体pGEM-α′,经XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切得到目的基因与载体pET-28a连接构建重组原核表达载体pET-28a-α′,将经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确的表达载体转入感受态细胞E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白α′-亚基。对重组α′-亚基的诱导表达条件进行筛选,发现在菌液OD600值为0.8、诱导温度30℃、IPTG浓度为0.2mmol/L的诱导条件下诱导9h后α′-亚基的表达量较高,重组α′-亚基的分子质量大小约为70ku;工程菌pET-28a-α′-BL21经超声破碎、离心后发现重组α′-亚基部分存在于上清液中,部分形成包涵体蛋白。重组α′-亚基的克隆及表达为β-伴大豆球蛋白结构及功能特性的研究奠定基础。

大豆皮中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和凝集素免疫活性的检测

由于大豆皮具有多种有益的功能,因而被添加于多种动物的饲料中。国内外学者对大豆皮的研究主要集中在大豆皮的可消化性和能量价值,而对大豆皮中抗营养因子组成及含量的研究报告非常的少。本文用竞争ELISA法对大豆皮中具有免疫活性大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和凝集素的含量进行了测定,结果显示生大豆皮中具有免疫活性的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和凝集素的含量分别为25.3、41.4和12.2mgg-1,说明大豆皮中含有相当高水平的抗营养因子。因此,大豆皮添加到动物饲料中之前,必须经过适当的加工处理,以在最大程度上灭活其中具有免疫活性的抗营养因子,且应该注意添加量等问题。

大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白对反刍前犊牛致敏作用的研究

8头初生荷斯坦公犊牛,随机分为A、B两组,每组4头。分别饲喂含生全脂大豆粉的代乳料和全乳。1、3、7、10、14、18、22、26、30、34、38、42日龄早饲前采血5mL,分离血清,以提纯大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白及其相邻收集馏分(7S二峰、11S二峰)为抗原,采用ELISA方法测定血清中特异性抗体滴度。结果表明:A组犊牛自10日龄起全部开始腹泻,20日龄左右粪便中可见脱落的肠黏膜,而B组犊牛无腹泻发生;A组犊牛血清中各种大豆抗原蛋白的特异性抗体滴度均极显著地(P<0.01)高于B组;饲喂初乳后,3日龄血清抗体滴度出现一个峰值;在持续饲喂大豆蛋白的情况下,6周龄内血清抗体持续升高,未见下降趋势,其中7S二峰致敏性高于大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和11S二峰;β-伴大豆球蛋白在30日龄前致敏性高于大豆球蛋白和11S二峰。

糖基化对β-伴大豆球蛋白热聚集行为的影响研究(Ⅰ)

基于Maillard反应的机理,采用干热法分别制备出7S和不同分子量葡聚糖(67kDa、150kDa、500kDa)的三种糖基化产物,从糖基化产物的热性质分析到热聚集体的浊度、粒径,研究了糖基化对于7S在pH和离子强度诱导下的热聚集行为。结果显示,糖基化具有抑制7S热聚集行为的作用,并且葡聚糖在分子量为67kDa和150kDa时的糖基化产物抑制效果相近且优于分子量为500kDa的葡聚糖糖基化产物。

β-伴大豆球蛋白糖基化改性对其乳化性影响的研究

以低温脱脂豆粕为原材料分离纯化得到β-伴大豆球蛋白(7S)。以黄原胶为糖基供体对7S进行湿法糖基化改性,用Box-Behnken模型对反应条件进行优化,并测定分析改性产物在不同环境下的乳化性。结果表明最佳反应条件为:反应温度90℃,反应时间2h,糖添加量7%,乳化活性(EAI)为1.132,乳化稳定性(ESI)为27.16min,分别是未改性7S球蛋白的2.15倍和2.26倍。研究结果证明,糖基化改性是改善7S乳化性的有效途径。

透明质酸-大豆β-伴球蛋白涂膜对微冻鲤鱼的保鲜效果

目的研究不同比例透明质酸和大豆β-伴球蛋白复合膜处理对鲤鱼肉微冻贮藏品质的影响。方法用浓度为0.9%的透明质酸(hyaluronic acid,HA)分别和1%、2%、3%大豆β-伴球蛋白配制3种涂膜剂,涂膜分割鲤鱼肉后进行‒3℃微冻贮藏,测定鲤鱼肉持水力、电导率、pH、色度、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸(thiobarbituric reactive substances,TBARS)值、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)可溶性肽以及肌原纤维蛋白、表面疏水性、羰基、巯基和钙离子ATP酶(calcium-ATPase,Ca^(2+)-ATPase)活性的变化。结果未涂膜鲤鱼肉在微冻贮藏14 d后品质显著下降,HA-大豆β-伴球蛋白复合膜可有效抑制微冻鲤鱼肉持水力、肌原纤维蛋白、巯基和Ca^(2+)-ATPase活性的下降(P<0.05),延缓TVB-N、TBARS、TCA可溶性肽、电导率和羰基的增长速率(P<0.05)。0.9%HA-2%大豆β-伴球蛋白复合膜保鲜28 d时,较未涂膜鲤鱼肉电导率、TVB-N、TBARS和TCA可溶性肽分别降低20.2%、48.9%、62.6%和20.7%;肌原纤维蛋白含量和持水力分别高40.6%、27.9%。结论0.9%HA-2%大豆β-伴球蛋白复合膜保鲜效果最好,该复合涂膜剂可有效延缓微冻鲤鱼肉的品质劣变,延长货架期。

β-伴大豆球蛋白来源生物活性肽的研究进展

β-伴大豆球蛋白是大豆中的主要贮藏蛋白质,结构分析表明它是一种糖蛋白。本文阐述了以β-伴大豆球蛋白为基质酶解得到的具有免疫调节功能的糖肽和SOYMETIDE,以及具有抗氧化、降低胆固醇、调节胃肠道功能的活性肽研究状况,并对其今后研究发展方向作了展望。