革兰氏阴性细菌β-桶状结构外膜蛋白体外折叠的研究进展

除了细胞质膜,革兰氏阴性细菌细胞还有一层组成细胞壁的外膜(Outer Membrane)。膜蛋白是外膜的主要组成成分之一,绝大多数外膜蛋白是由反向平行的β-折叠(β-Strands)通过相邻的氢键结合形成的β-桶状结构蛋白(β-Barrel Proteins)。这些蛋白既可作为通道蛋白、转运蛋白、酶、受体、毒力因子,也可作为结构蛋白发挥稳定外膜的重要作用,它们是否正确折叠并整合到外膜对革兰氏阴性细菌的生存至关重要。大多数外膜蛋白易于重组表达和体外重折叠(in vitro refolding),并且折叠状态可通过多种方法测定,因此β-桶状结构外膜蛋白被当着模式蛋白来研究各类生物和非生物因子对膜蛋白折叠的影响,是膜蛋白研究的一大热点。本文将从β-桶状结构外膜蛋白体外折叠的研究方法和影响折叠的因素角度对近年相关研究进展进行综合述评,最后总结了外膜蛋白体外折叠模式,并结合作者的相关研究结果和观点对该领域的研究前景进行了展望。

溴结构域蛋白4经PTEN/PI3K/AKT通路对甲状腺乳头状癌细胞摄碘相关指标影响的研究

目的研究溴结构域蛋白4(BRD4)在甲状腺乳头状癌(PCT)中的表达水平及其抑制剂JQ1对PCT细胞增殖、迁移能力的影响,进一步探索影响摄碘能力的调控机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术及蛋白质印迹法分别检测BRD4在正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1及人PCT细胞TPC-1、K1的表达水平。采用CCK-8及划痕实验分别检测JQ1对TPC-1、K1细胞增殖及迁移能力的影响。采用高内涵细胞成像与分析系统观察TPC-1、K1细胞在JQ1作用下的形态及数目变化。采用qRT-PCR技术检测影响PCT摄碘能力相关基因的表达。结果BRD4在PCT细胞及癌组织中高表达。JQ1对TPC-1、K1细胞增殖能力呈时间及浓度依赖性抑制。TPC-1、K1细胞的48 h半抑制浓度分别为(9.045±0.772)、(14.169±1.406)μmol/L。JQ1可以抑制TPC-1、K1细胞的迁移,且具有统计学意义(P<0.05)。JQ1分别作用于TPC-1、K1细胞48 h后,实验组BRD4、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的mRNA表达水平降低。第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)、钠-碘转运蛋白的mRNA表达升高。结论BRD4在PCT中呈现高表达状态。JQ1可有效抑制BRD4的表达,并影响PTEN/PI3K/AKT通路从而抑制PCT细胞的增殖及迁移,使得其摄碘能力增加。

M^(pro)-C蛋白三维结构域交换的机理:来自分子模拟的线索(英文)

SARS冠状病毒主蛋白酶(Mpro)在病毒的蛋白酶切过程中发挥着重要作用.Mpro的晶体结构显示它存在两种形式的二聚体:一种是发生三维结构域交换的形式,另一种是非交换的形式.Mpro的C端结构域(Mpro-C)单独表达时也能形成与全长Mpro类似的三维结构域交换二聚体.三维结构域交换通常发生在蛋白质的表面,但Mpro-C的结构域交换却发生在疏水核心.在本文中,我们利用分子动力学模拟及三维结构域交换预测算法研究了Mpro-C中被高度埋藏的核心螺旋片段发生交换的机理.我们发现基于结构与基于序列的已有算法都不能正确预言出Mpro-C和Mpro中发生结构域交换的铰链区位置.分子模拟结果表明Mpro-C中的交换片段在天然态下埋藏得很好,但在变性单体中则会被释放并暴露在外面.因此,在完全或部分解折叠状态下交换片段的打开有助于促进单体间的相互作用及结构域交换二聚体的形成.

膜蛋白结构预测的研究进展

综述近年来膜蛋白结构预测的研究进展,分类介绍了α螺旋和β桶状跨膜蛋白结构预测方法之基本原理和应用。作为重要的基因产物之一,跨膜蛋白在生物体中发挥各种重要功能,而膜蛋白偶联受体是大多数药物的作用靶点。基于结构的药物设计是目前药物研发的主要方法,可膜蛋白的三维结构很难采用X-光晶体衍射和核磁共振技术测定,因此应用生物信息学方法预测膜蛋白结构成为当今研究热点。

miR-486-3p靶向DDR1对口腔鳞状细胞癌的抑制作用及槟榔致口腔鳞状细胞癌的可能机制

目的探讨miR-486-3p靶向盘蛋白结构域受体1(DDR1)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)的抑制作用,并基于miR-486-3p和DDR1分析槟榔致OSCC的可能机制。方法(1)收集20例原发性OSCC患者肿瘤组织及癌旁组织以检测miR-486-3p的表达水平。(2)取人口腔表皮癌(OEC)-M1细胞,分为对照1组(常规培养细胞,不给予任何特殊处理)、miR-486-3p mimic组(转染miR-486-3p mimic)、miR-486-3p inhibitor组(转染miR-486-3p inhibitor),以及对照2组(常规培养细胞,不给予任何特殊处理)、OE-DDR1组(转染过表达DDR1的慢病毒质粒)、sh-DDR1组(转染低表达DDR1的慢病毒质粒)。检测各组细胞增殖能力,以及活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、Caspase-3蛋白表达水平。检测对照1组、miR-486-3p mimic组、miR-486-3p inhibitor组DDR1 mRNA的表达水平。(3)取HEK293细胞,分别转染miR-486-3p mimic和野生型或突变型DDR13端非翻译区。通过TargetScan数据库及双荧光素酶实验分析miR-486-3p与DDR1的结合情况。(4)取OKF4/TERT-1细胞,分为无槟榔碱组(不给予槟榔碱处理)和槟榔碱组(用槟榔碱连续刺激5 d),检测两组细胞miR-486-3p、DDR1 mRNA及蛋白表达水平。结果(1)与癌旁组织相比,OSCC组织中miR-486-3p表达水平降低(P<0.05)。(2)与对照1组/对照2组相比,miR-486-3p mimic组/sh-DDR1组OEC-M1细胞增殖能力降低,cleaved Caspase-3表达水平升高,而miR-486-3p inhibitor组/OE-DDR1组OEC-M1细胞增殖能力增高,cleaved Caspase-3表达水平降低(均P<0.05)。与对照1组相比,miR-486-3p mimic组OEC-M1细胞的DDR1 mRNA表达水平降低,miR-486-3p inhibitor组DDR1 mRNA表达水平升高(均P<0.05)。(3)miR-486-3p与野生型DDR1存在结合位点。(4)与无槟榔碱组相比,槟榔碱组OKF4/TERT-1细胞中miR-486-3p表达水平降低,DDR1 mRNA和蛋白表达水平升高(均P<0.05)。结论miR-486-3p通过靶向下调DDR1的表达,抑制OSCC细胞增殖,促进OSCC细胞凋亡,进而发挥抑癌作用。槟榔可能通过调控miR-486-3p和DDR1的表达从而诱发OSCC。

靶向大肠埃希菌外膜蛋白的18β-甘草次酸的筛选及抗菌活性评价系统构建

目的以大肠埃希菌桶状蛋白组装复合物的核心组分BamA和BamD作为靶点,从甘草提取物中进行抗菌活性成分的筛选,以应对日益严峻的抗生素耐药问题。方法使用亲和超滤联合高效液相色谱-质谱(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)技术,从甘草提取物中筛选能够与BamA和BamD相互作用的化合物。用荧光定量PCR检测化合物处理后大肠埃希菌外膜蛋白bamA和bamD基因表达量的变化,并且利用离体重组系统检测化合物对于β桶状蛋白组装(β-barrel assembly machinery,BAM)复合物整合外膜蛋白功能的影响,最后利用SDS在细菌细胞内的积累情况检测化合物处理过后细菌细胞膜完整性变化。结果生物亲和超滤联合HPLC-MS筛选发现18β-甘草次酸可以与BamD发生相互作用,经18β-甘草次酸处理后,大肠埃希菌bamA基因表达水平升高1.5倍,bamD基因表达水平升高2倍,但是,离体重组系统检测未观察到18β-甘草次酸对BAM复合物的插膜功能具有抑制效果,细胞膜完整性检测实验也未发现18β-甘草次酸对于大肠埃希菌细胞膜的破坏。结论以BamA和BamD蛋白作为靶点,建立了使用亲和超滤联合HPLC-MS进行天然产物筛选的方法。筛选得到18β-甘草次酸能够与BamD相互作用并能够影响大肠埃希菌外膜蛋白的表达,故本研究所建立的筛选和实验流程对于以外膜蛋白为靶点的、其他来源的新型抗菌药物的筛选具有良好的借鉴价值,且本研究也提示在筛选过程中,相关靶点的选择对成功筛选到相应的天然产物至关重要。

微小RNA-758-3p在舌鳞状细胞癌细胞株中的表达及其对肿瘤细胞增殖和迁移的影响

目的观察微小RNA(miRNA,miR)-758-3p在舌鳞状细胞癌细胞株中的表达,探讨其对肿瘤细胞增殖和迁移的影响。方法采用实时定量反转录聚合酶链反应(qPCR)检测miR-758-3p在人舌鳞状细胞癌细胞株和人正常口腔黏膜细胞细胞中的表达。脂质体转染miR-NC(对照组)或miR-758-3p(实验组)至舌鳞状细胞癌细胞。生物信息学预测及双荧光素酶报告基因验证miR-758-3p和靶基因的靶向关系。qPCR和Western blot检测TRIM44基因及下游蛋白的表达。流式细胞术、MTT法和Transwell迁移实验分别检测过表达miR-758-3p对细胞周期、增殖能力和迁移能力的影响。结果 miR-758-3p在舌鳞状细胞癌细胞株中呈现低表达(P<0.01)。TRIM44为miR-758-3p的直接靶基因(P<0.01)。转染miR-758-3p后的TSCCA中,TRIM44基因表达降低(P<0.05),细胞周期进展被抑制(P<0.01),增殖能力明显下降(P<0.01),细胞迁移能力受到抑制(P<0.01)。结论 miRNA-758-3p在舌鳞状细胞癌细胞株中表达降低,通过靶向干扰TRIM44基因的表达抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖和迁移。

肿瘤转移相关基因蛋白1、基质金属蛋白酶-2和卷曲螺旋结构域67蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

目的探讨甲状腺乳头状癌（PTC）及癌旁腺体组织中肿瘤转移相关基因蛋白1（MTA1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）与卷曲螺旋结构域67蛋白（CCDC67）表达水平及相关性。方法采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法，检测61例PTC癌组织及癌旁组织石蜡切片MTA1、MMP-2及CCDC67蛋白的表达。利用慢病毒转染技术构建CCDC67过表达的TPC-1细胞株。采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测PTC细胞株中MTA1、MMP-2及CCDC67 mRNA的表达。结果MTA1蛋白在PTC组织中的表达率为63.9%（39/61），在癌旁组织中的表达率为18.0%（11/61）；MMP-2蛋白在PTC组织中的表达率为62.3%（38/61），在癌旁组织中的表达率为14.8%（9/61）；CCDC67蛋白在PTC组织中的表达率为49.1%（30/61），在癌旁组织中的表达率为96.7%（59/61）。CCDC67蛋白在PTC组织中的表达分别与肿瘤大小、TNM分期、病理分级、淋巴结转移因素中表达率差异有统计学意义（χ2＝3.911、7.289、10.353、8.826，P＝0.048、0.007、0.001、0.003），MTA1和MMP-2的表达与TNM分期、病理分级、淋巴结转移因素中表达率差异有统计学意义（χ2＝6.213、12.752、4.665，P＝0.013、0.000、0.031；χ2＝5.026、5.026、6.036，P＝0.025、0.025、0.014）。TPC-1细胞株中，MTA1和MMP-2 mRNA均有表达，未检测到CCDC67 mRNA表达。在构建的CCDC67高表达的TPC-1细胞株（OE组）中，MTA1与MMP-2 mRNA水平较正常TPC-1细胞株（CON组）及转染了空载体的TPC-1细胞株（NC组）中均呈现相对低表达。结论MTA1、MMP-2、CCDC67蛋白与PTC的转移和侵袭密切相关，CCDC67基因的抑癌功能可能与其抑制细胞转、移侵袭相关蛋白的表达有关。

人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区甲基化状态的研究

目的:探讨6种人食管鳞癌细胞株KYSE150,KYSE510,TE13,EC9706,CaEs17和EC109中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;观察特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对存在甲基化的细胞株RIZ1基因的转录调控作用及其对该细胞生长增殖的影响。方法:甲基化特异PCR(MSP)法检测6种人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;实时定量PCR法检测5-Aza-CdR处理前后RIZ1基因启动子区CpG岛高度甲基化的人食管鳞癌细胞株TE13中RIZ1 mRNA表达量的变化;MTT法检测5-Aza-CdR对TE13细胞生长增殖的影响。结果:(1)6种人食管鳞癌细胞株中TE13,CaEs17,EC109三株细胞RIZ1基因启动子区存在甲基化;(2)5-Aza-CdR处理细胞株TE13后,RIZ1 mRNA表达量上调;(3)5-Aza-CdR能抑制TE13的生长增殖,并随时间的延长和浓度的增加抑制作用变明显。结论:启动子区CpG岛高度甲基化是人食管鳞癌细胞株TE13 RIZ1基因表达沉默的重要原因;5-Aza-CdR能使TE13 RIZ1 mRNA表达上调;并能抑制TE13细胞的生长增殖,并呈时间和浓度依赖性。

甘草素抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖的机制研究

目的研究甘草素通过微RNA-486-3p(microRNA-486-3p,miR-486-3p)靶向盘蛋白结构域受体-1(discoidin domain receptor 1,DDR1)抑制口腔鳞状细胞癌及其作用机制。方法采用不同浓度甘草素处理人口腔鳞状细胞癌SCC-15细胞48 h,MTT法检测甘草素对细胞生存率的影响。将细胞分为对照组、甘草素组、miR抑制剂组、病毒对照组、抑制慢病毒组和过表达慢病毒组,RT-PCR检测miR-486-3p和DDR1表达;5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)染色检测细胞增殖情况;Western blot检测cleaved Caspase-3和Caspase-3表达。将细胞分为转染对照组和转染组,使用包含野生型或突变型DDR13'-UTR的双荧光素酶报告基因检测系统检测miR-486-3p和DDR1的结合情况。结果与0μmol/L甘草素比较,100、120、150μmol/L甘草素能明显抑制SCC-15细胞的生存率(P<0.05)。与对照组比较,甘草素组miR-486-3p的相对表达量、cleaved Caspase-3/Caspase-3相对比率均明显升高(P<0.05),DDR1的相对表达量、EdU阳性细胞相对比值均明显降低(P<0.05)。与甘草素组比较,miR抑制剂组miR-486-3p的相对表达量、cleaved Caspase-3/Caspase-3相对比率均明显降低(P<0.05),DDR1的相对表达量、EdU阳性细胞相对比值均明显升高(P<0.05)。与病毒对照组比较,抑制慢病毒组EdU阳性细胞相对比率明显降低(P<0.05),cleaved Caspase-3/Caspase-3相对比率明显升高(P<0.05);过表达慢病毒组EdU阳性细胞相对比率明显升高(P<0.05),cleaved Caspase-3/Caspase-3相对比率明显降低(P<0.05)。miR-486-3p与DDR1存在结合位点。与转染对照组比较,转染组相对荧光素酶活力明显降低(P<0.05),野生型DDR13'-UTR相对荧光素酶活力明显降低(P<0.05)。结论甘草素通过miR-486-3p靶向DDR1抑制SCC-15细胞增殖,促进细胞凋亡,进而发挥抗肿瘤作用。

SMYD2和FA2H表达与甲状腺乳头状癌关系的临床研究

目的:探究甲状腺乳头状癌(PTC)组织中SET和MYND结构域蛋白2(SMYD2)、脂肪酸2-羟基化酶(FA2H)的表达及其与临床病理特征、预后的关系。方法:收集2013年6月至2015年2月我院手术治疗的PTC患者的组织样本(癌组织和癌旁正常组织),实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测组织样本中SMYD2、FA2H mRNA表达情况;以SMYD2、FA2H mRNA表达水平的中位数为界,分为高表达组和低表达组,分析SMYD2、FA2H表达与PTC临床病理特征及预后的关系;多因素Cox回归模型分析PTC患者预后影响因素。结果:与癌旁正常组织相比,PTC癌组织中SMYD2、FA2H mRNA相对表达量增加(均P<0.05)。PTC癌组织中,SMYD2表达与肿瘤侵犯包膜、浸润深度及临床分期相关(均P<0.05);FA2H表达与肿瘤直径、淋巴结转移及临床分期相关(均P<0.05)。SMYD2高表达组与低表达组患者的5年总生存率(OS)、5年无病生存率(RFS)比较,差异有统计学意义(均P<0.05);FA2H高表达组与低表达组患者的5年OS、5年RFS比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。多因素Cox回归模型分析结果表明,SMYD2表达水平、FA2H表达水平、淋巴结转移及临床分期是影响PTC患者预后的危险因素。结论:PTC癌组织中SMYD2、FA2H均呈高表达状态,且均与较差临床病理特征、不良预后相关;SMYD2、FA2H可能是预测PTC患者预后的潜在指标。

甲状腺乳头状癌中卷曲螺旋结构域蛋白67基因mRNA和蛋白的表达及其相关性

目的 探讨甲状腺乳头状癌（PTC）细胞株TPC-1、甲状腺鳞癌细胞株SW579、分化型甲状腺癌细胞株FTC-133以及PTC组织中卷曲螺旋结构域蛋白67（CCDC67）基因mRNA和蛋白表达的相关性.方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术,检测甲状腺癌细胞株以及56例PTC及对应癌旁组织中CCDC67基因mRNA和蛋白表达.结果 甲状腺癌细胞株中均无CCDC67基因mRNA和蛋白的表达.癌旁组织中均出现CCDC67 mRNA和蛋白的表达.PTC组织中CCDC67 mRNA的表达率为41.4％ （23/56）,蛋白的表达率为46.4％（26/56）,两者均与患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移明显相关（P＜0.05）.CCDC67 mRNA与蛋白的表达明显相关（P＜0.05）.结论 CCDC67在甲状腺癌细胞株中表达缺失,CCDC67 mRNA及其蛋白在PTC组织中表达水平均低于癌旁组织,CCDC67基因在PTC的发生、发展中起着重要作用.

人食管鳞状细胞癌组织TIM-3表达临床意义

目的观察食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中T细胞免疫球蛋白结构域分子3(TIM-3)表达,结合患者预后进行分析。方法收集豫北安阳肿瘤医院、南阳中心医院等河南食管癌高发区医院病理科存档的1994-2014年手术切除、石蜡包埋食管癌及癌旁组织蜡块225例,免疫组织化学方法(IHC)检测生存期<5年组、≥5年组共150例食管癌及75例癌旁组织中TIM-3子表达;Kaplan-Meier(K-M)法分析TIM-3表达与患者预后关系。结果生存期<5年组≥5年组、癌旁对照组间TIM-3表达差异有统计学意义,P<0.05;TIM-3蛋白表达与患者有无淋巴结转移有关,P<0.05;TIM-3表达与患者预后无关,P>0.05。结论阳性淋巴结转移者TIM-3表达增强;TIM-3不是患者预后危险因素。

环氧合酶-2蛋白、错配修复蛋白及核蛋白Ki67的表达与结直肠腺癌组织学分型的相关性研究

目的探讨不同组织学类型结直肠腺癌组织中环氧合酶-2(COX2)蛋白、错配修复蛋白及核蛋白Ki67(Ki67)表达的差异性。方法收集173例结直肠腺癌组织样本,用免疫组化检测COX2、错配修复蛋白及Ki67蛋白的表达情况。结果在173例结直肠腺癌患者中,管状腺癌140例、黏液腺癌22例和微乳头状结构腺癌11例。管状腺癌组、黏液腺癌组和微乳头状结构腺癌组的COX2蛋白阳性率分别为59.29%,27.27%和45.45%,错配修复蛋白阳性率分别为97.86%,95.45%和63.63%,Ki67蛋白阳性率分别为79.29%,50.00%和36.36%。黏液腺癌组的COX2蛋白阳性率与管状腺癌组比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。微乳头状结构腺癌组的错配修复蛋白阳性率与其他2组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);管状腺癌组的Ki67蛋白阳性率与其他2组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论COX2蛋白、错配修复蛋白及Ki67蛋白的表达能够在免疫组化中辅助结直肠腺癌分型。

新型多功能蛋白家族DABB类蛋白研究进展

DABB类蛋白含有1~2个二聚化α+β桶状结构域(dimeric α+β barreldomain,DABB)。DABB结构域最早在嗜氢菌的果糖1,6二磷酸醛缩酶的C端和盐胁迫下胡杨的热休克蛋白(Hsp90)、羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)中发现。目前报道的该类蛋白主要存在于植物、细菌和真菌中,在动物中尚无报道。在植物中,DABB类蛋白与植物抵御多种病原真菌入侵和非生物胁迫相关。在微生物中,DABB类蛋白主要参与氧化还原相关的代谢过程。目前,关于DABB结构域的具体功能仍不清楚,尚无关于DABB类蛋白的综述文献,本综述从含有此结构域的DABB类蛋白的物种来源、DABB结构域的特点及其保守氨基酸、DABB类蛋白的系统进化等方面,对植物和细菌DABB类蛋白的研究现状进行了总结,并对该类蛋白的研究与应用前景进行了展望。