寡聚态β-淀粉样肽_(1～42)可通过胶质-炎症反应损伤神经元

目的观察寡聚态β-淀粉样肽1～42(Oligo-Aβ1～42)诱导的小胶质细胞条件培养液对Neuro-2A神经元细胞的影响,探讨炎症介质在胶质介导的神经元损伤中的作用。方法以Oligo-Aβ1～42诱导BV-2细胞,制备小胶质细胞条件培养液,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定Neuro-2A神经细胞的活力,AO-EB染色荧光显微镜观察计数细胞凋亡和坏死率;酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定小胶质细胞培养上清中的肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)及前列腺素E2(PGE2)水平;Griess法检测上清NO水平;免疫印迹法测定小胶质细胞胞质环氧合酶2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平。结果Oligo-Aβ1～42诱导的小胶质细胞条件培养液(Aβ-CM)明显引起Neuro-2A神经细胞损伤,MTT法显示神经元活力随Aβ诱导剂量的增加而逐渐下降(P<0.01),并且浓度为1.0μmol/L和5.0μmol/L的Aβ-CM组比同浓度Aβ单纯组神经细胞的存活率更低,分别为(53.75±3.95)和(34.61±2.72)(Aβ-CM组与Aβ单纯组相比P<0.05,P<0.01);联合作用组(Aβ-CM+Aβ)神经细胞存活率下降更明显,两因素方差分析显示,Aβ诱导的小胶质细胞条件培养液与单纯Aβ(1.0μmol/L)有协同作用[F(3,39)=53.16,P<0.001]。AO-EB荧光观察计数显示,低浓度(0.2μmol/L)Oligo-Aβ1～42诱导的小胶质细胞条件培养液可引起神经细胞发生凋亡性损伤,较高浓度(1.0～5.0μmol/L)Oligo-Aβ1～42诱导不仅引起神经细胞凋亡,还引起细胞发生坏死性改变。进一步研究显示,低浓度(0.2～5.0μmol/L)的Oligo-Aβ1～42明显增加小胶质细胞培养上清中TNF-α、PGE2、NO的产量及胞质COX-2和iNOS蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),呈现一定的量效关系。结论低浓度Oligo-Aβ1～42可通过胶质-炎症反应加剧神经元损伤,其作用可能与Oligo-Aβ1～42诱导小胶质细胞产生炎症介质及胞质内COX-2、iNOS蛋白表达水平增高有关。

与IGFBP-3相关的RXRα、STAT-1信号通路在β-淀粉样肽_(1～42)诱导大鼠海马神经元凋亡中的可能作用

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、视网膜X受体α(RXRα)及信号转导子和转录激动子(STAT-1)在β-淀粉样肽1～42(Aβ1～42)诱导大鼠海马神经元凋亡中的可能作用。方法以原代培养的大鼠海马神经元为模型,分为对照组和Aβ1～42组,加入不同浓度的凝聚态Aβ1～42,原位缺口末端标记法(TUNEL)观察凋亡细胞的形态;免疫细胞荧光方法检测凋亡细胞及IGFBP3、RXRα阳性细胞;免疫印迹法检测RXRα蛋白和STAT-1蛋白的表达水平。结果20μmol/LAβ1～42作用大鼠海马神经元24h能明显诱导神经元凋亡,表现为TUNEL/DAPI染色出现阳性细胞;20μmol/LAβ1～42作用大鼠海马神经元3～6h后IGFBP3阳性细胞、RXRα阳性细胞、RXRα蛋白的表达水平均较对照组有明显增高(P<0.01),在较高水平保持一段时间后逐渐下降;而STAT-1蛋白的表达水平则显著降低(P<0.01)。结论IGFBP3/RXRα或STAT-1信号转导通路可能在Aβ1～42诱导大鼠海马神经元凋亡中起一定作用。

β-淀粉样多肽1-42(Aβ_(42))多克隆抗体的制备及其鉴定

目的 :β -淀粉样多肽 1 - 4 2 (Amyloidβ1 -42 ,简称Aβ42 )是存在于阿尔茨海默病 (Alzheimer′sDis ease,AD)患者脑组织中的特异病理改变之物 ,同时它在AD患者的脑积液及血浆中有所改变。我们制备Aβ42多克隆抗体及其建立测定方法 ,是希望找到一个特异性鉴定AD的生物指标。方法 :将Aβ42 多肽与匙孔虫戚血蓝蛋白 (KLH)偶联 ,免疫新西兰白兔从而产生抗 -Aβ42 多克隆抗体。此特异性抗体可用于ELISA、Western印迹法和免疫组织化学的方法中 ,并可测定AD脑组织中的特异性淀粉样沉淀物。结果 :通过免疫组织化学法鉴定此抗 -Aβ42 多克隆抗体 ,结果显示在AD患者的脑组织淀粉样沉淀物中呈阳性。同时应用Western印迹法对Aβ42 抗体进行了鉴定 ,结果显示Aβ42 多肽的分子量与Aβ42 多肽标准的 4 5kDa分子量相一致。结论 :我们所制备的Aβ42 多克隆抗体能与Aβ42 抗原呈特异性结合 ,这就为研究淀粉样前体蛋白 (APP)

β-淀粉样肽对大鼠原代海马神经细胞中SIRTs表达的影响

目的:探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)对原代培养海马神经细胞中沉默信息调节因子(SIRTs)表达的影响。方法:分离出生24 h内SD乳鼠大脑海马区域,培养原代神经细胞,CCK-8试验观察0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5及2.0μmol/L Aβ寡聚体(AβOs)对细胞增殖的影响,选取恰当浓度的AβOs进行后续实验;将实验分为对照组(Control)和Aβ组,Aβ组给AβOs处理24 h后,运用Western blotting方法及Realtime PCR方法检测SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5的蛋白及mRNA表达水平。结果:CCK-8结果显示,0.5μmol/L AβOs作用于大鼠原代海马神经细胞24 h时细胞存活率明显低于对照组(P<0.05),且不影响细胞的存活率;0.5μmol/L AβOs处理大鼠原代海马神经细胞24 h后,与Control相比,SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5蛋白及mRNA表达水平均不同程度降低(P<0.05或0.01)。结论:AβOs可使海马神经细胞中SIRTs蛋白及mRNA表达水平降低,这可能与AD病人发病后学习记忆能力减退有关。

二甲双胍降低肥胖大鼠海马内PPARγ、IDE表达伴随TNF-α和Aβ42表达上调

二甲双胍(metformin,MET)常用于肥胖胰岛素抵抗患者改善胰岛素抵抗降低血糖,但MET可增加脑内β-淀粉肽(β-amyloid,Aβ)表达,目前机制不清.Aβ沉积作为阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)始发病理生理学改变,在AD中发挥重要作用.为研究MET对脑内Aβ表达的影响及机制,采用饮食诱导肥胖大鼠模型(OB组)予MET灌胃4 W后(MET组),观察海马内Aβ42及相关因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activatedreceptorγ,PPARγ)、胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme,IDE)的表达.结果显示,OB组大鼠血糖水平较对照组(CTL组)无明显差异,胰岛素含量明显升高(P<0.01),并存在胰岛素抵抗;OB组大鼠海马内TNF-α、Aβ42水平较CTL组上调,PPARγ、IDE表达下降(P<0.05).MET组胰岛素及胰岛素抵抗均较OB组降低(P<0.05),海马内TNF-α、Aβ42表达增加(P<0.01);PPARγ,IDE表达较OB组减少(P<0.01).上述结果提示,二甲双胍作为治疗肥胖胰岛素抵抗的一线用药,可改善胰岛素抵抗,但增加海马内炎性因子TNF-α表达、减少PPARγ水平,降低其调控IDE转录作用,使IDE表达减少,伴随Aβ42降解减少沉积增加,从而可能增加AD发病风险.

β-淀粉样肽40／42与2型糖尿病及动脉粥样硬化的关系

检测2型糖尿病、动脉粥样硬化（AS）患者血清β-淀粉样肽（AB）40和Aβ42水平。结果显示，Aβ40在糖尿病组高于对照组：（274．70±159．51对162．63±87．58）pg／ml，P〈0．05]，糖尿病合并As组升高更显著：（616．95±195．13）pg／ml，P〈0．01]；单纯As组Aβ40水平也明显高于对照组i（318．52±188．65）pg／ml，P〈0．05]．提示Aβ40是2型糖尿病合并As的危险因素。而各组间Aβ42水平差异无统计学意义。

轻度认知功能障碍患者Aβ1-42、Tau蛋白、Lp-PLA2水平变化及其与脑电图的关系

目的探讨轻度认知功能障碍(MCI)患者血清β-淀粉样多肽(1-42)(Aβ1-42)、Tau蛋白、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)水平的变化及其与脑电图参数的相关性。方法选取老年MCI患者80例(MCI组)、阿尔茨海默病(AD)患者80例(AD组)、健康体检者80名(正常对照组),收集所有对象的一般资料,检测其血清Aβ1-42、Tau蛋白、Lp-PLA2水平,并行脑电图检查。比较各组各项检测、检查结果的差异。采用Pearson相关分析评估各项指标之间的相关性。结果AD组、MCI组、正常对照组血清Aβ1-42水平依次升高(P<0.05),血清Tau蛋白和Lp-PLA2水平依次降低(P<0.05)。MCI组、AD组α1波、δ波、θ波脑电功率均高于正常对照组(P<0.05);AD组δ波、θ波脑电功率均高于MCI组(P<0.05);3个组α2波、β1波、β2波脑电功率差异均无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关分析结果显示,MCI患者δ波、θ波脑电功率与Aβ1-42水平呈负相关(r值分别为-0.447、-0.482,P值分别为0.001、<0.0001),与Tau蛋白呈正相关(r值分别为0.571、0.467,P<0.0001),与Lp-PLA2水平无相关性(r值分别为0.117、0.163,P>0.05)。结论老年MCI患者Aβ1-42、Tau蛋白和Lp-PLA2水平会发生异常变化,且与脑电图参数有一定的相关性。

β-淀粉样肽对人SH-SY5Y细胞突触素、发动蛋白I及衔接蛋白180表达的影响

目的探讨β-淀粉样肽（Ap）对人SH—SY5Y神经母细胞瘤细胞突触素（syn）、发动蛋白I（DynI）及衔接蛋白180（AP180）表达的影响。方法分别应用0．01、0．1、1、2及5-μmol／LAβ1-42处理SH-SY5Y细胞，对照组细胞不加任何处理。MTT法检测细胞增殖情况，western blotting检测0．5、1μmol／LAμ1-42处理组及对照组细胞Syn、DynI和AP180蛋白表达，RT—PCR检测1μmol／LAβ1-42处理组及对照组细胞Syn、DynI和AP180mRNA表达。结果0．1μmol／LAl3Im处理细胞即可出现细胞增殖率下降，并呈剂量依赖性负性相关关系．与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；0．5μmol／LAB1-42处理细胞可见DynI蛋白表达降低，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；1μmol／LAβ1-42处理细胞可见Syn、DynI蛋白及mRNA表达均降低，与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；但未见AP180蛋白及mRNA表达水平发生改变。结论AB1-42可引起人SH-SY5Y细胞Syn和DynI表达降低，该改变可能与AD发病中学习记忆能力减退有关。

虾青素提高血管性痴呆小鼠学习记忆能力

目的探讨腹腔给药虾青素对于血管性痴呆(VaD)小鼠学习记忆能力的影响及其作用机制。方法采用双侧颈总动脉夹闭法建立小鼠VaD模型后随机分成假手术组、模型组、虾青素低剂量组及虾青素高剂量组,分别给予相应形式的药物治疗。Morris水迷宫观察各组小鼠的学习记忆及空间探索能力,尼氏染色、免疫组织化学染色、Western blotting及ELISA检测小鼠脑神经元的病理形态、脑内β-淀粉样肽42(Aβ_(42))蛋白表达及炎症相关因子白细胞介素(IL)-4及IL-6含量。结果模型组小鼠第4天及第5天的平均逃避潜伏期较假手术组显著增加(P<0.05),平台穿越次数及停留时间显著下降(P<0.05);尼氏染色显示,模型组小鼠海马区神经元固缩,排列紊乱,神经元数量较假手术组明显减少;经过不同剂量虾青素治疗干预后,小鼠的第4天和第5天平均逃避潜伏期较模型组显著下降(P<0.05),平台穿越次数及停留时间显著延长(P<0.05),神经元排列层次分明,尼氏染色阳性细胞较模型组明显增加,效果呈剂量依赖性。另外,免疫组织化学染色、Western blotting及ELISA检测显示,不同剂量虾青素干预组较模型组脑内Aβ_(42)蛋白及IL-6含量显著下降(P<0.05),IL-4含量显著增加(P<0.05)。结论虾青素能够降低脑内神经毒性蛋白Aβ_(42)的表达以及抑制脑内炎症反应,从而发挥神经元保护作用,改善小鼠的学习记忆能力。

黄精丸对阿尔茨海默病大鼠大脑的抗氧化作用及Aβ1-42,APP蛋白表达的影响

目的:探讨黄精丸药方(Huangjingwan,HW)对阿尔茨海默病(AD)大鼠大脑的抗氧化作用及β-淀粉样多肽1-42(Aβ1-42),淀粉样前体蛋白(APP)表达的影响。方法:SD大鼠随机分成正常组,假手术组,AD模型组,HW低、中、高剂量组(相当药丸剂量1,3,9 g·kg-1·d-1组)。给大鼠腹腔注射1. 25%D-半乳糖液(120 mg·kg-1·d-1,连续6周)后,再右侧脑室一次性注射Aβ1-4210μg,制作大鼠AD模型;造模2周后各药物组大鼠灌胃相应剂量试验药物,假手术组及AD模型组大鼠灌胃给生理盐水1 m L,每天1次。灌胃持续8周。采用跳台实验评价各大鼠的学习记忆能力;体质量10%的负荷游泳实验测试各大鼠的体能耐力变化;比色法检测各大鼠大脑组织超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽还原酶(GR),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)抗氧化酶系活性,谷胱甘肽(GSH)与丙二醛(MDA)含量变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各大鼠大脑组织白细胞介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),Aβ1-42与APP蛋白含量变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各大鼠大脑APP蛋白表达变化。结果:与正常组比较,AD模型组大鼠表现出明显的痴呆状态,少动易呆卧,学习反应时间延长,学习记忆错误次数显著增多,体能衰减明显,大脑内抗氧化酶(SOD,GR,GSH-Px)活性及抗炎因子GSH水平显著降低,炎症因子MDA,IL-1β,TNF-α水平显著升高,Aβ1-42蛋白含量显著升高,APP蛋白含量显著下降(P <0. 01)。与AD模型组比较,HW低、中、高剂量均可改善AD大鼠的痴呆症状,提高学习记忆成绩,改善机体虚弱、提高体能,升高大脑内SOD,GR,GSH-Px活性及抗炎因子GSH水平,降低MDA,IL-1β,TNF-α水平,并能降低大脑内Aβ1-42及升高APP蛋白水平(P <0. 05,P <0. 01);且1~9 g·kg-1·d-1剂量范围内的HW,随剂量增加,药效作用越明显。结论:HW有防治AD的功能,这一作用与HW可以增强脑内抗氧化系统功能、降低神经炎症反应、降低氧化应激引发的Aβ1-42沉积、维持APP蛋白表达水平等有关。

老年轻度认知功能障碍中医证型的客观化研究

目的:探讨老年轻度认知功能障碍(MCI)中医证型与β-淀粉样多肽1-42(Aβ1-42)、白介素6(IL-6)、血栓弹力图(TEG)的相关性,为老年MCI中医辨证分型的客观化提供参考依据。方法:随机选取老年MCI心脾两虚证、肾精亏虚证、痰浊蒙窍证、瘀血阻窍证患者各30例,以同期健康老年体检者30例作为对照组,分别检测和比较各组的Aβ1-42、IL-6和血栓弹力图指标(R、K、Angle、MA)。结果:老年MCI患者的血清Aβ1-42、IL-6均较对照组升高(P<0.05或P<0.01)。各中医证型组间比较,痰浊蒙窍组的Aβ1-42、IL-6显著升高;瘀血阻窍组的Aβ1-42、Angle、MA显著升高,R、K降低。结论:老年MCI的血清Aβ1-42、IL-6较正常老年人显著升高,可以作为老年MCI辨病诊断的参考;老年MCI不同中医证型间Aβ1-42、IL-6和血栓弹力图指标(R、K、Angle、MA)存在差异,可作为辨证分型的参考。