低氧诱导因子-1α转染对骨髓间充质干细胞与β-磷酸三钙支架相容性的影响研究

目的探讨应用脂质体将Hif-1α稳定转染至MSCs是否影响其与β-TCP支架的相容性。方法应用直接贴壁法提取原代MSCs,流式细胞仪鉴定干细胞表面抗原并行向成骨细胞诱导分化鉴定。通过脂质体将Hif-1α转染至第3代(P3)MSCs,经遗传霉素(G418)筛选获得稳定转染的细胞。将β-TCP支架分为两组:A组,MSCs与β-TCP支架共培养;B组,Hif-1α稳定转染的MSCs与β-TCP支架共培养。观察比较两组样品中MSCs的成活细胞数和生长曲线,分析Hif-1a稳定转染对MSCs与β-TCP支架相容性的影响。结果 Hif-1α转染前后MSCs均可在β-TCP支架上良好生长,且两组细胞均保持细胞干性,两组间细胞数目和细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Hif-1α转染不会对MSCs在β-TCP支架上的生长增殖产生影响。

3D打印β-磷酸三钙支架复合淫羊藿苷微粒修复兔股骨头坏死

背景:前期研究制备了3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架。目的:观察3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架在兔股骨头坏死模型中的修复作用。方法:取新西兰大白兔(南京青龙山实验动物中心提供),制作激素型股骨头坏死模型,将造模成功的27只兔进行髓芯减压及清理死骨,随机分3组,分别植入自体骨(自体骨组)、β-磷酸三钙支架(磷酸三钙组)及3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架(复合支架组)。植入后第4,8,12周,进行股骨头micro-CT扫描及病理组织观察。结果与结论:①micro-CT显示,植入第4周,3组植入物周围及内部均有骨小梁生成;自体骨组植入后第8周植骨区有大量骨小梁,植入后第12周骨小梁结构致密;磷酸三钙组、复合支架组支架与骨界面整合良好,复合支架组植入第4周时支架附近有一定量的骨小梁生成,至第8周时支架上有骨小梁长入,磷酸三钙组植入第4周时仅可见微量薄弱骨小梁,第8周时才可见支架周围广泛骨小梁生成,第12周时骨小梁仍较其他两组稀疏;②植入第12周苏木精-伊红染色显示,自体骨、复合支架组成骨细胞分化成熟,软骨基质较少,新生骨组织与植入物整合良好,磷酸三钙组仍存在较多的软骨基质,新生骨与植入物尚未完成整合;③植入第12周Masson染色显示,复合支架组成骨细胞增殖低于自体骨组(P <0.05),但高于磷酸三钙组(P <0.05);④植入第12周TRAP染色显示,复合支架组破骨细胞数少于磷酸三钙组(P <0.05),与自体骨组比较无差异(P> 0.05);⑤植入第12周免疫组织化学染色显示,复合支架组血管内皮生长因子阳性率高于磷酸三钙组(P <0.05),但低于自体骨组(P <0.05);⑥结果表明,3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架植入股骨头坏死模型兔体内,可促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞活性,同时促进新生血管生成,具有促进兔股骨头坏死修复的作用。

聚己内酯增强β-磷酸三钙复合支架的制备及力学性能

针对生物陶瓷在大段骨缺损的修复重建中韧性不足的问题,采用数字光处理技术和涂层工艺,制备了集高强度韧性一体化的生物陶瓷β-磷酸三钙/聚己内酯复合支架,并研究了聚己内酯涂层浓度对复合支架抗压抗弯性能和微观形貌的影响。实验结果表明:聚己内酯涂层可有效提高β-磷酸三钙陶瓷支架的力学性能,复合支架的强度和韧性均与聚己内酯涂层浓度呈正相关性;随着聚己内酯涂层浓度的提高,复合支架的可靠性显著提高,涂层效果有明显的改善,但不均匀现象也越明显;结合力学性能和微观形貌评价发现,0.20 g/mL聚己内酯增强β-磷酸三钙复合支架的综合性能最佳。该研究可为制备满足骨生长到骨强化两阶段力学性能要求的复合支架提供参考。

骨形态发生蛋白2基因转染人羊水干细胞复合β-磷酸三钙支架促进骨再生

目的研究重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因转染人羊水干细胞（hAFSC）的体外成骨分化，评价基因修饰的hAFSC负载于β-磷酸三钙（β-TCP）多孔支架后体内成骨能力。方法收集人工破膜后的中段羊水原代培养hAFSC，免疫磁珠分选CDl17／c-kit阳性的hAFSC，分别转染腺病毒介导的BMP-2或增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，转染组转染BMP-2和EGFP基因、对照组转染无BMP-2编码序列的EGFP基因，空白组不做病毒转染。48h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达及生长状况，应用流式细胞仪检测转染率。转染第7、14、21、28天采用ELISA检测各组hAFSC培养液中的BMP．2分泌量以确认转染后目的蛋白表达效果。各组hAFSC成骨诱导14d后进行碱性磷酸酶（ALP）染色，28d后进行茜素红染色评价成骨能力；成骨诱导3、7、14d后定量检测各组细胞ALP活性。20只8周龄裸小鼠随机分为Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组、Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP组、hAFSC-β-TCP组和β-TCP组，每组5只，将细胞载体复合物植入各组裸小鼠股骨，8周后观察异位成骨组织学情况。结果hAFSC生长良好，Adv-hBMP-2或Adv-EGFP基因转染48h后荧光显微镜下见细胞贴壁良好，发出强绿色荧光，无死细胞产生，转染阳性率达（89．00±4．25）％。转染Adv-hBMP-2组hAFSC培养液上清中BMP-2第7、14、21、28天分别为（3．405±0．229）μg／L、（4．575±0．179）μg／L、（3．910±0．175）μg／L、（2．694±0．205）μg/L，第14天蛋白BMP-2分泌已达到高峰且第28天仍有蛋白表达，各时间点均明显高于对照组与空白组（均P〈0．05）。hAFSC成骨诱导14d后细胞相连成片，与对照组及空白组比较，ALP染色转染组染色阳性面积更大、阳性细胞数量更多。成骨诱导28d后茜素红染色见转染组细胞多中心聚集，伴大量红色钙结节形成，结节数量与大小明显优于对照组与空白组。成骨诱导3、7、14d后各组ALP表达均升高，其中转染组AIJP分泌逐渐增多，各时间点均高于空白组及对照组（均P〈0．05）：对照组及空白组ALP分泌在成骨诱导3、7、14d后均升高，各时间点ALP定量差异无统计学意义。体内植入8周后，Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组较其余3组材料降解更快，骨形成更多，未见纤维组织产生；Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP和hAFSC-β-TCP组出现少量新生骨，材料降解较慢；β-TCP组单独植入后无明显降解，少量新生骨形成。结论BMP-2基因转染的hAFSC有利于加强骨再生。

含纳米银颗粒的β-磷酸三钙复合支架的抗菌性和促成骨性的研究

目的研究一种含5%(质量分数)纳米单质银颗粒的-磷酸三钙复合支架(β-TCP-Ag)的细胞毒性及在家兔体内的抗菌性和促成骨性能,从而为临床治疗骨髓炎合并大面积骨缺损提供新的思路。方法体外:以100%-磷酸三钙支架(β-TCP)作为对照组,在体外用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测支架浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)的细胞毒性;体内:选取新西兰大白兔28只,以β-TCP为对照,一期在4周内建立兔股骨骨髓炎模型,再二期植入支架后分别饲养4周和12周,然后取支架植入区域骨组织,用平板涂布法检测金黄色葡萄球菌菌落的相对个数;用显微电子计算机断层扫描(Micro-CT)观察支架植入区域骨组织长入情况。结果CCK-8检测显示各组间细胞相对活性未见明显差异,表明β-TCP-Ag在体外未见有明显细胞毒性;细菌平板涂布法显示植入β-TCP-Ag组材料周围骨组织培养金黄色葡萄球菌菌落数远小于β-TCP组;Micro-CT分析表明β-TCP-Ag组骨缺损区域骨量明显高于β-TCP组。结论含5%纳米银颗粒的-磷酸三钙复合支架具有良好的生物相容性和抗菌能力,在体内杀灭细菌后有利于骨缺损的愈合,是一种良好的抗菌和骨缺损植入物材料。在改进骨感染合并骨缺损的治疗中具有重要的潜能。

β-磷酸三钙多孔支架联合自体干细胞治疗犬股骨头缺血性坏死的实验研究

目的探讨β-磷酸三钙多孔支架联合自体干细胞移植对股骨头缺血性坏死(ONFH)的修复效果。方法采用液氮冷冻法建立犬ONFH模型,然后应用髓芯减压、髓芯减压多孔钽棒植入、β-磷酸三钙多孔支架植入、β-磷酸三钙多孔支架联合自体干细胞移植的方法对骨坏死灶进行充填,通过植入前后股骨头的影像学观察、生物力学测定、组织学观察和骨形态计量学测定来考察不同方法植入治疗股骨头缺血性坏死的效果。结果采用β-磷酸三钙多孔支架联合自体干细胞移植能使骨坏死有明显好转,术后24周新生骨面积依旧在不断加大,并出现造血组织;能使股骨头维持较长时间较高的抗压强度,与其他方法相比差异有统计学意义(P<0.05);同时术后24周在骨体积分数、类骨质体积分数及矿化沉积率上比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论β-磷酸三钙多孔支架联合干细胞移植法有利于股骨头缺血性坏死的修复,具有良好地应用前景。

上颌窦提升中羟基磷灰石/β-磷酸三钙/壳聚糖/甲基纤维素组织工程骨的成骨效应

背景:前期实验构建了羟基磷灰石/β-磷酸三钙/壳聚糖/甲基纤维素三维复合支架材料,发现其具有良好的理化性能和生物相容性。目的:评估可注射性羟基磷灰石/β-磷酸三钙/壳聚糖/甲基纤维素支架复合骨髓间充质干细胞用于兔上颌窦提升的成骨效果。方法:取24只新西兰大白兔(新疆医科大学动物实验中心提供),每只兔均制作4处上颌窦提升区域,其中3处分别植入可注射性羟基磷灰石/β-磷酸三钙/壳聚糖/甲基纤维素支架与骨髓间充质干细胞复合物(实验组)、可注射性羟基磷灰石/β-磷酸三钙/壳聚糖/甲基纤维素支架(对照组1)、羟基磷灰石/β-磷酸三钙骨粉(对照组2),最后一处不植入任何材料,作为空白对照。术后4,8,12周,取上颌窦提升区域标本,分别进行锥形束CT扫描、苏木精-伊红染色与免疫组织学化染色观察。实验经新疆医科大学第一附属医院实验动物伦理委员会审议批准(批准编号IACUC20170706-02)。结果与结论:①锥形束CT显示,空白对照组始终无新骨生成,其余3组术后8周时可见新骨生成,且以实验组成骨效果最明显;术后12周时,实验组、对照组1、对照组2成骨效果进一步增强,3组间差异不明显;②苏木精-伊红染色显示,实验组术后8,12周的成骨效果优于对照组1、对照组2(P<0.05);③免疫组织化学染色显示,实验组术后8周的成骨指标骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子表达均强于对照组1、对照组2(P<0.05);术后12周时,3组间两指标表达差异不明显(P>0.05);④结果表明,羟基磷灰石/β-磷酸三钙/壳聚糖/甲基纤维素可注射组织工程骨可促进上颌窦提升区域的骨形成。

多孔钙磷陶瓷表面浸涂制备明胶/HA复合涂层

目的采用有机泡沫浸渍法制备β-磷酸三钙(β-TCP)多孔生物陶瓷,以明胶/羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)复合浆料对其进行表面浸涂处理。本研究旨在保证高孔隙率的前提下提高多孔支架的综合性能。方法利用X-射线衍射仪对β-TCP多孔生物陶瓷进行相组成分析,并研究多孔支架涂覆前后的孔隙率和孔隙特征的变化以及不同明胶/HA比例对支架性能的影响。结果β-TCP多孔生物陶瓷烧结后的主要成分为(Ca,Mg)3(PO4)2和β-Ca2P2O7。涂覆前后多孔支架的孔隙率并没有发生明显改变,但涂覆处理后表面粗糙度明显增大,涂层与支架具有良好的结合界面,涂层中有大量的微孔存在。结论涂覆处理在β-TCP多孔生物陶瓷支架孔隙率基本不变的情况下,成功地在其表面制备出明胶/HA复合涂层,随之形成的粗糙表面形貌,将有利于细胞的早期粘附。

生物素-亲和素桥接系统在骨组织工程中的应用

目的:观察生物素-亲和素桥接系统(avidin-biotin binding system,ABBS)对骨组织工程中种子细胞与支架材料黏附的影响,探讨ABBS在骨组织工程的作用。方法:以脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞、β磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)作为支架材料建立组织工程骨模型。实验分为两组,对照组:ADSCs与多孔β-TCP支架复合物结合;实验组:ABBS修饰的ADSCs与多孔β-TCP支架复合物结合。通过免疫荧光以及流式细胞仪检测ADSCs生物素化的效率。计算并比较两组的细胞黏附率;在扫描电镜下观察ADSCs与多孔β-TCP支架黏附的表面情况。结果:生物素化的ADSCs荧光染色显示生物素结合部位在细胞胞质,且流式细胞仪检测提示生物素化细胞阳性率为95%。ADSCs与多孔β-TCP支架复合物结合10min、30min、60min、12h、24h时,对照组和实验组的细胞黏附率分别为(2.31±0.14)%和(21.75±4.69)%、(11.96±2.53)%和(54.82±12.37)%、(33.48±9.51)%和(78.69±15.65)%、(78.29±10.63)%和(95.46±7.38)%、(94.79±10.42)%和(98.13±1.45)%。生物素化的ADSCs与亲和素化多孔β-TCP支架材料的黏附效果在10min、30min、60min、12h4个时间点明显高于未修饰的ADSCs与多孔β-TCP支架的黏附效果(P<0.05)。电镜下观察,ABBS组与对照组无明显差别。结论:ABBS可以促进ADSCs在支架上早期黏附,有利于细胞增殖,并且对组织工程骨的生物相容性无明显影响。

动态培养对骨髓间充质干细胞在三维多孔支架中成骨分化的影响

目的研究动态培养条件下人骨髓来源的间充质干细胞在三维多孔支架中的成骨状况。方法从人骨髓中分离间充质干细胞进行体外培养扩增,将第3代细胞与多孔β-磷酸三钙支架复合。对细胞/支架复合体进行动态灌注培养(动态培养组)以及静态培养(静态培养组),28d后采用MTT法检测三维支架中细胞的增殖,通过p-磷酸硝基苯法检测碱性磷酸酶活性,以及应用ELISA方法检测培养过程中骨桥蛋白及骨钙素的分泌。同时对培养后的细胞/支架复合体进行电镜观察及组织学检测,观察人骨髓间充质干细胞形成矿化细胞外基质的能力。结果培养28d后,动态培养组细胞增殖及ALP活性显著高于静态培养组(P<0.05)。整个培养过程中,动态培养组骨桥蛋白及骨钙素的分泌高于静态培养组。静态培养组中细胞仅在多孔支架周缘增殖,而动态培养组中细胞则在整个支架内增殖。另外,动态培养组支架中形成的组织及新生骨明显多于静态培养组(P<0.05)。结论动态培养有利于人骨髓来源的间充质干细胞在三维多孔支架中增殖并向成骨方向分化。

利用灌注式生物反应器体外构建大段组织工程化骨的实验研究

目的研究体外利用灌注式生物反应器构建大段组织工程化骨的可行性。方法把在体外培养扩增的第三代人骨髓基质干细胞与大段多孔β-磷酸三钙（β-TCP）支架复合。将细胞／支架复合体放入灌注式生物反应器中，进行连续灌注培养。28d后，检测细胞的增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性，同时对培养后的细胞／支架复合体进行组织学检测及形态学计量，用以评价体外组织工程化骨的构建。以静态培养作为对照组。结果培养28d后，灌注培养组的细胞活性明显高于静态培养组。灌注培养组细胞的ALP活性显著高于静态培养组。静态培养组细胞仅在多孔β-TCP支架周缘增殖，形成的新骨量较少。灌注培养组细胞在整个β—TCP支架内增殖，形成的新骨量较多。结论利用灌注式生物反应器的灌注培养，可以使人骨髓基质干细胞在大段β-TCP载体内增殖并形成新骨，使体外大段组织工程化骨的构建成为可能。