南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆和序列分析

以南丰蜜橘[Citrus reticulata Blanco var.kinokuni(Tanaka)H.H.Hu]基因组DNA为模板,根据已报道的柑橘β-胡萝卜素羟化酶基因保守序列设计4对引物,进行PCR扩增,得到4条长度为470、761、294和991 bp的片段.将这些片段克隆到pMD18-T载体,并进行测序.测序结果拼接成1条2 326 bp的序列.分析发现该序列含6个内含子,7个外显子.内含子两侧有典型的GT-AG保守序列.该序列中预测的编码序列与温州蜜柑、拟南芥等植物的β-胡萝卜素羟化酶基因序列保守性达80%以上,表明该序列确实为β-胡萝卜素羟化酶基因.该基因编码了1个含311个氨基酸的蛋白.将该序列递交到GenBank数据库,序列号为AM408552.

植物β-胡萝卜素羟化酶的生物信息学分析

采用生物信息学方法对GenBank中的拟南芥、玉米、龙胆、福寿草和水仙等植物β-胡萝卜素羟化酶(BCH)的核苷酸和氨基酸序列进行了比对分析,进而对其组成成分、理化性质、信号肽、亚细胞定位、疏水性/亲水性、跨膜结构域、功能结构域、基序及蛋白质二级结构等重要参数进行了预测和分析。结果表明,BCH基因全长约为1256bp,具有完整的开放阅读框,长约为943bp,编码313个氨基酸,分子量为34.82kD,理论等电点为9.18,含量最丰富的氨基酸都包含Ala(10.34%)、Leu(8.7%)和Gly(8.1%);无信号肽,定位于叶绿体中的亲水性不稳定蛋白,含有3-4个跨膜结构域,一个功能结构域,二级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主要构件。

植物β-胡萝卜素羟化酶研究进展

-β胡萝卜素羟化酶是植物类胡萝卜素合成代谢中的关键酶,它催化了植物中β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素合成玉米黄素的过程。β-胡萝卜素羟化酶广泛存在于植物、蓝藻和细菌等生物中,其基因在植物中成对出现,在原核生物中则处于基因簇内。该酶是一种非血红素双铁单加氧酶,分子中有富含组氨酸的模体。多种生物的β-羟化酶基因已被克隆并分别在细菌、蓝藻或植物中表达。玉米黄素能帮助植物抵御胁迫环境,β-隐黄素对癌症等人类疾病有抑制作用。采用基因工程手段改造β-羟化酶基因,将为培养高抗逆性作物和大规模生产β-隐黄素提供新途径。

羽衣甘蓝β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala)为试验材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到羽衣甘蓝β-胡萝卜素羟化酶的c DNA全长,命名为Bo BCH(Gen Bank登录号为MH016242)。序列分析表明,该c DNA序列长906 bp,编码301个氨基酸,分子量33. 8 ku,理论等电点为9. 67。保守结构域分析表明,Bo BCH属于FA_hydroxylase蛋白超家族。系统发育分析结果表明,羽衣甘蓝与结球甘蓝处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Wolf-Psort进行跨膜区分析及亚细胞定位,结果表明Bo BCH蛋白有4个跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥作用。q RT-PCR检测结果表明,Bo BCH在紫叶羽衣甘蓝DH系D07的根、茎、叶中均有表达,在叶片中表达量最高,茎次之,根中表达量最低;不同发育时期的检测结果表明,Bo BCH在观赏期叶片中表达最高,在幼苗期和莲座期表达水平较低。

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的转录表达模式及功能分析

为了明确烟草β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,β-OHase)基因的转录表达模式和功能,进而调控烟草类胡萝卜素的代谢,通过Real-time PCR分析了普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元盛花期的β-OHase基因在不同器官中的表达量。利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中β-OHase基因的表达,在该基因成功沉默后,通过Real-time PCR检测其下游基因表达量,同时检测烟草中β-胡萝卜素、紫黄质和新黄质含量(质量分数)。结果显示,β-OHase基因在叶片中的表达量明显高于其他器官(P<0.05)。与对照相比,在该基因沉默后,下游的紫黄质脱环氧化酶基因(VDE)和玉米黄质环氧化酶基因(ZE)的表达量明显降低,同时β-胡萝卜素含量显著升高,而紫黄质和新黄质含量则显著降低(P<0.05)。

枇杷β-胡萝卜素羟化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物β-胡萝卜素羟化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以枇杷基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约450 bp的DNA片段,克隆人pMD-18T载体中,测得该基因片段长为440 bp,编码145个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在GenBank中进行同源性检索,结果该序列与苹果β-胡萝卜素羟化酶基因同源性为95%,证明它属于枇杷的β-胡萝卜素羟化酶基因。

南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶基因内含子的鉴定和分析

植物β-胡萝卜素羟化酶(简称β-羟化酶)是玉米黄素合成过程中的关键酶。柑橘、拟南芥、大白菜等多种植物β-羟化酶基因都已被克隆。柑橘中合成玉米黄素的中间产物β-隐黄素的含量远远高于其它植物,推测柑橘与其它植物的β-羟化酶基因相比有一些特殊的差异。本研究以南丰蜜橘为材料,克隆了柑橘β-羟化酶全长基因,并对该基因内含子进行定位和分析,结果表明南丰蜜橘β-羟化酶基因具有6个内含子,其中内含子6的长度远大于拟南芥和大白菜中相应的内含子。进一步研究发现内含子6中有两段特殊序列,一段长122 bp,另一段长95 bp。特别是122 bp序列两端具有反向重复序列,全序列中含有许多不同的转录起始原件。二级结构预测其对应RNA二级结构能构形成较稳定的发夹结构。

万寿菊胡萝卜素羟化酶基因 TeCHYE 克隆与分析

α-胡萝卜素ε环羟化酶(α-caroteneε-ring hydroxylase,CHYE)是植物类胡萝卜素合成途径下游关键酶,催化叶黄素的形成。万寿菊(Tagetes erecta L.)是菊科园艺作物,富含类胡萝卜素,尤其是叶黄素,可用于天然色素的提取。文章根据万寿菊的转录组数据,通过花组织RNA提取、反转录合成cDNA,以克隆获得编码万寿菊α-胡萝卜素ε环羟化酶的基因TeCHYE,连接于克隆载体pEASY-Blunt。序列分析结果显示,该基因为读码框全长1656 bp、编码相对分子质量约62 kDa的亲水性蛋白。进化分析表明,CHYE基因在植物中保守存在,万寿菊TeCHYE与同科植物向日葵HaCHYE同源性最高。进一步对万寿菊叶片、不同发育时期花组织中叶黄素的质量比及其TeCHYE基因表达水平进行分析,结果显示,TeCHYE在花的发育过程中表达水平显著升高,表明其参与了叶黄素在万寿菊花中的合成积累。

绿色杜氏藻不同β-胡萝卜素羟化酶基因家族胁迫应答模式研究

β-胡萝卜素羟化酶(β-carotenoid hydroxylase,CHYB)是植物类胡萝卜素生物合成途径中的一个重要限速酶。本研究对绿色杜氏藻转录组测序数据进行分析,获得2条β-胡萝卜素羟化酶家族基因chyb1和chyb2。采用染色体步移法分别克隆并获得了绿色杜氏藻chyb1和chyb2基因的启动子序列,全长分别为1080 bp(Gen Bank登录号:KY012338)和1155 bp(Gen Bank登录号:KY012339)。利用Plantcare软件分析两个启动子的顺式作用元件,结果表明绿色杜氏藻chyb1基因启动子含有与甲基茉莉酸、花生四烯酸、水杨酸等非生物胁迫相关的顺式作用元件,而绿色杜氏藻chyb2基因启动子含有与光照相关的顺式作用元件。通过q RT-PCR分析了绿色杜氏藻CHYB基因家族在不同胁迫下的基因表达水平,结果表明该基因家族的基因表达水平与启动子调控相关,且不同的家族基因应答不同的胁迫。

雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR技术,从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis 34-1n)总RNA中扩增出β-胡萝卜素羟化酶基因cDNA序列,将此序列亚克隆于pMD 18-T simple Vector上,经过序列测定,表明该基因的开放阅读框为879bp,编码292个氨基酸,与雨生红球藻(H. pluvialis Flotow NIES-144)β-胡萝卜素羟化酶基因氨基酸序列相比,其在编码氨基酸的第33位有一个氨基酸的缺失。在15、314、9和56位上的氨基酸也存在差异。多序列比对分析表明,雨生红球藻与莱茵衣藻的亲缘关系较近,与其他高等植物以及细菌的亲缘关系相对较远。

桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为揭示桂花不同品种β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,HYB)基因的序列差异,利用已构建的桂花花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合RT-PCR技术对桂花品种玉玲珑、金球桂、堰虹桂和日香桂中2个β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB1和HYB2)的最大阅读框进行扩增,并测序验证。生物信息学分析结果表明,4个桂花品种HYB1基因均含有长为909 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸残基; HYB2基因均含有长为915 bp的开放阅读框,编码304个氨基酸残基。4个桂花品种HYB1和HYB2推导的氨基酸序列均具备保守的组氨酸结构域。HYB1基因核苷酸序列存在27个变异位点,其氨基酸序列存在8个变异位点; HYB2基因核苷酸序列存在12个变异位点,其氨基酸序列存在3个变异位点。进化树分析结果发现,4个桂花品种的HYB1和HYB2蛋白与茄科植物番茄和辣椒HYB蛋白亲缘性最高。

普通烟草β-胡萝卜素羟化酶2基因克隆与生物信息学分析

β-胡萝卜素羟化酶(beta-carotene hydroxylase,BCH)是植物类胡萝卜素合成代谢中的关键限速酶,为获得烟草β-胡萝卜素羟化酶2(NtBCH2)基因序列,采用同源克隆法从烟草中分离NtBCH2的基因组DNA序列,基因登录号为JX101477。结果表明:1)同源克隆法从烟草中克隆出NtBCH2基因,NtBCH2基因组DNA全长2131bp,cDNA为1 083bp,含7个外显子和6个内含子。2)NtBCH2蛋白有309个氨基酸,分子量为34.79kD,具有7个糖基化位点,11个磷酸化位点,4个跨膜域。3)系统发育树与BLAST分析表明,NtBCH2是番茄的SlBCH和辣椒CaBCH2的同源基因;GENEVESTIGATOR数据库芯片结果表明,NtBCH2在幼嫩的茎和子叶中表达量最高。

毛竹β-胡萝卜素羟化酶基因的分子特征及其功能

【目的】β-胡萝卜素羟化酶(BCH)是催化β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素合成玉米黄质的关键酶,玉米黄质在植物光保护过程中发挥着重要作用。通过研究毛竹β-胡萝卜素羟化酶基因(Pe BCH)的结构特点、表达特征和功能,为揭示强光胁迫条件下PeBCH在竹子光保护中的作用提供证据,为培育抵抗强光胁迫的植物新品种提供新的基因资源。【方法】以毛竹为对象,通过同源克隆的方法分离PeBCH,利用生物信息学软件分析其结构特点,采用实时荧光定量PCR技术分析基因的组织表达特性,构建PeBCH基因的过量表达载体,并在拟南芥中异位表达,通过对转基因拟南芥植株的表型和生理变化来鉴定PeBCH基因的功能。【结果】从毛竹中获得了1个BCH同源基因序列,命名为PeBCH;该基因的全长1 385 bp,编码区为927 bp,编码区对应的基因组序列为1 566 bp,包含5个内含子、6个外显子,内含子完全符合GT-AG剪接原则。PeBCH编码1个308个氨基酸的蛋白,PeBCH蛋白具有BCH家族的特征结构域PD095142和PD011050,存在4个跨膜结构,二级结构含有无规则卷曲、延伸链和α螺旋3种,其中以无规则卷曲覆盖的氨基酸残基最多。组织表达特异性分析表明,PeBCH基因在毛竹的根、幼茎、叶片、叶鞘、节中均检测到表达,但表达丰度存在着显著差异,其中在叶片中的相对表达丰度最高。不同光照处理影响PeBCH基因的表达,随着光强的增大该基因的表达丰度呈现先上升后下降的趋势,其中光强1 000μmol·m-2s-1处理后基因的表达丰度最高,约为对照的1.5倍,但光强1 500μmol·m-2s-1处理后,PeBCH基因的表达丰度显著下降,仅为对照的5%,明显受到强光的抑制。利用PeBCH基因转化拟南芥后,RT-PCR分析表明PeBCH基因在转基因植株中得到表达;与野生型拟南芥相比,转PeBCH基因拟南芥植株生长健壮,叶绿素、类胡萝卜素、胡萝卜素和叶黄素含量均有所增加;在实验室环境光强(145μmol·m-2s-1)和强光(530μmol·m-2s-1)条件下,转PeBCH基因植株的NPQ明显高于野生型植株,二者NPQ的稳定值间差异达到极显著水平(P<0.01)。【结论】Pe BCH在毛竹中为组成型表达,光照处理(<1 000μmol·m-2s-1)诱导其在叶片中的表达。该基因的过量表达有助于提高转基因植株的热耗散能力,抵抗强光胁迫。该基因将是今后植物抗逆分子育种的重要基因资源之一。

南丰蜜橘β-萝卜素羟化酶的生物信息学分析

利用多种在线软件对本实验室克隆测序的南丰蜜橘（Citrus reticulata Blanco var.kinokuni（Tanaka）H.H.Hu）β-胡萝卜素羟化酶（chy，蛋白序列号CAL63739）的理化性质、亲水性、跨膜区及空间结构进行了预测。理化性质分析显示其含311个氨基酸分子量为34 785.4，pI值为9.03。该酶定位于类囊体膜上，TMpred跨膜分析显示它含有4个显著的跨膜螺旋区，这些区域与ProtScale预测的疏水区基本重叠。该酶二级结构以α-螺旋为主，且含多种磷酸化位点。结构域分析显示该酶含β-羟化酶家族的特征结构域PD095142（99-156aa）和PD011050（157-280aa）。借助HHpred三级结构预测结果，分析了该酶的结构特征及可能的膜定位方式。本文为进一步研究该酶结构和功能的关系打下了基础。

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的特征分析

β-胡萝卜素羟化酶基因在植物类胡萝卜素的合成代谢过程中起着关键的作用。烟草中的类胡萝卜素是烟叶香气物质的主要前体物之一。本研究克隆了烟草4个β-胡萝卜素羟化酶基因。烟草β-胡萝卜素羟化酶基因与其它作物的BCH基因具有相似的结构,由7个外显子和6个内含子组成。其编码的蛋白包含BCH蛋白的保守结构域,即脂肪酸羟化酶超家族保守域。进化分析表明,烟草Nt BCH蛋白与番茄、枸杞、辣椒等茄科作物的BCH蛋白遗传距离较近。组织特异性表达分析表明,Nt BCH1和Nt BCH2基因主要在叶和花中表达,Nt BCH3和Nt BCH4主要在根和花中表达。从本研究结果推断,可以通过调控Nt BCH1和Nt BCH2基因的表达控制烟叶中类胡萝卜素的含量。

芹菜β-胡萝卜素羟化酶基因AgBCH1的克隆及表达特性分析

胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase, BCH)在植物类胡萝卜素生物合成中起着重要的作用。芹菜是伞形科一种重要的叶菜类蔬菜作物,含有丰富的类胡萝卜素。本文以芹菜‘六合黄心芹’为实验材料,从中克隆获得编码芹菜β-胡萝卜素羟化酶的基因AgBCH1。序列分析结果显示,该基因全长933 bp,编码310个氨基酸。进化树分析表明,芹菜AgBCH1蛋白的进化高度保守,与同科的胡萝卜DcBCH1蛋白的进化关系最为相近。序列比对分析显示,植物BCH1氨基酸序列具有较高的同源性,芹菜与同科的胡萝卜BCH1氨基酸序列一致性达到87.94%。Ag BCH1蛋白相对分子质量34 505.73,理论等电点9.10,为亲水性蛋白。芹菜Ag BCH1蛋白三级蛋白结构包括5个α螺旋及6个β折叠,无序化比例为14.84%。利用实时定量PCR对经过低温(4°C)、高温(38°C)、盐(0.2mol·L-1 Na Cl)、干旱(200 g·L-1 PEG) 4种非生物胁迫处理的60 d芹菜叶片中Ag BCH1基因的相对表达量进行检测,发现Ag BCH1基因对这4种逆境胁迫均有响应,尤其对高温胁迫响应明显,且高温处理8 h后表达量最高。

Bkt基因和crtR-B基因在集胞藻PCC 6803中的重组表达及功能分析

将雨生红球藻中的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)经密码子优化后,通过自然转化法分别转入集胞藻PCC 6803基因组中。高效液相色谱分析显示:转入bkt基因的细胞产生角黄质的同时,海胆酮含量减少;转入crtR-B基因的细胞产生金盏花黄质的同时,玉米黄素含量减少。实验结果表明,外源的β-胡萝卜素酮化酶基因将海胆酮转化为角黄质,外源的β-胡萝卜素羟化酶基因将玉米黄素转化为金盏花黄质。该文利用代谢工程策略,在集胞藻PCC 6803中构建类胡萝卜素生物合成途径,为通过代谢工程在集胞藻PCC 6803中生产虾青素奠定了基础。