虾青素法夫酵母β-胡萝卜素转化酶的生物信息学分析

以虾青素中法夫酵母酶氨基酸序列为研究对象,利用ProtParam、SignalP、PSORT、ProtScale、SOMPA、PredictProtein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在线预测工具,对其理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行分析。结果表明,该转化酶由557个氨基酸残基构成,是一种无信号肽,具有跨膜结构,定位于细胞色素氧化酶中的可溶性亲水蛋白。α螺旋和无规卷曲为主要的二级结构元件。三级结构以PDB ID 5vcc.1的B链为模板,功能预测为细胞色素P450。生物信息学手段分析预测结果可靠性较高,为进一步研究虾青素的生物合成调控机制提供了理论依据。

法夫酵母β-胡萝卜素转化酶(Asy)基因的克隆及可溶性表达研究

【目的】从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma)7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene,asy),并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达,为深入研究该酶的性质及应用提供基础。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术,克隆得到asy基因全长cDNA序列,将其克隆到表达载体pET32a中,通过优化温度和IPTG浓度提高其可溶表达量;进一步在E.coli BL21(DE3)中共表达携带asy基因的重组质粒和pACCAR16Δcrtx质粒(携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链),用液相色谱分析共转化菌株中类胡萝卜素种类的变化,鉴定可溶性表达的Asy酶活性。【结果】法夫酵母7B12菌株asy基因的cDNA序列与GenBank能检索到的唯一一条asy基因mRNA序列(Accession No.DQ002007.1)一致性达到97%,该序列总长1 971 bp,最大开放阅读框为1 614 bp,编码538个氨基酸,在E.coli BL21(DE3)中表达的Asy融合蛋白分子量约为70 kD;条件优化后转化asy基因的重组菌在26°C、0.5 mmol/L IPTG的条件下诱导时,可溶性融合蛋白比例达85%。与pACCAR16Δcrtx单质粒转化相比,共转化pACCAR16Δcrtx及asy基因的菌株类胡萝卜素产物的成分发生了明显的变化,其中α-胡萝卜素的含量明显减少,伴随出现了3种新的色素,根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物——β-隐黄质。【结论】从法夫酵母中克隆得到asy基因,通过优化诱导温度及IPTG浓度等条件提高了该基因在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达量,经鉴定可溶性的Asy融合蛋白具有转化β-胡萝卜素的活性。