雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮化酶是虾青素生物合成途径中关键酶之一,本研究通过基因枪法将克隆出的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt),转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中,经过含100mg/L壮观霉素固体培养基筛选得到转化子。通过PCR和基因组酶切Southern杂交分析,证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中。进一步通过RT-PCR和RT-PCR Southern杂交分析,表明bkt在衣藻转化子中得到表达。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因的cDNA和基因组DNA克隆及序列分析

根据已知的β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolase,BKT)的cDNA序列设计引物,利用长距离PCR扩增获得了bkt基因的cDNA完整编码片段及基因组DNA片段,并对这些片断进行了序列测定。cDNA和基因组DNA比对结果表明该基因至少包括5个内含子,它们的剪切位点皆符合GU-AG规律。在比对结果中同时还发现一个19bp的短序列重复,该重复序列在bkt的cDNA和基因组DNA上都发生了多次重复,推测在BKT的表达调控中可能具有一定功能。另外,在序列比对过程中还发现本实验所获得的cDNA和基因组DNA序列与前人报道的cDNA序列之间都存在多处单碱基差异和19bp的短序列差异。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析及叶绿体表达载体构建

β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶cDNA的克隆与序列分析

参照Kajiwara等人获得的β-胡萝卜素酮化酶cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增雨生红球藻的β-胡萝卜素酮化酶cDNA的完整编码片段并进行了序列测定与分析.结果表明,所获得cDNA序列与Kaji-wara等人报道序列具有96.4%的相似性,蛋白序列具有98.3%的相似性,说明所获得的cDNA序列确为β-胡萝卜素酮化酶的cDNA序列.

Bkt基因和crtR-B基因在集胞藻PCC 6803中的重组表达及功能分析

将雨生红球藻中的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)经密码子优化后,通过自然转化法分别转入集胞藻PCC 6803基因组中。高效液相色谱分析显示:转入bkt基因的细胞产生角黄质的同时,海胆酮含量减少;转入crtR-B基因的细胞产生金盏花黄质的同时,玉米黄素含量减少。实验结果表明,外源的β-胡萝卜素酮化酶基因将海胆酮转化为角黄质,外源的β-胡萝卜素羟化酶基因将玉米黄素转化为金盏花黄质。该文利用代谢工程策略,在集胞藻PCC 6803中构建类胡萝卜素生物合成途径,为通过代谢工程在集胞藻PCC 6803中生产虾青素奠定了基础。

雨生红球藻基因组文库的构建及鉴定

本研究以雨生红球藻34—1n为材料，提取其基因组DNA，利用限制性内切酶Sau3AI对基因组DNA进行酶解，回收6～8kb的基因组DNA片段，并浓缩至200ng／i,zL。该片段与经BamHI酶切和去磷酸化处理后的pUC18载体连接，然后电击转化到受体菌Escherichia.coliDH5仅中，获得雨生红球藻34-1n的基因组文库。该文库的平均插入片段长度约为6．5kb，获得6x10s个克隆数。通过PCR筛选，由雨生红球藻基因组文库中获得含bktl序列的单克隆菌，与β-胡萝卜素氧化酶序列（GenBank：DQ086233．1）进行比对，结果表明bktl基因组序列含有6个外显子。本研究为进一步鉴定雨生红球藻相关基因提供了一个文库平台。

虾青素合成关键基因在烟草中瞬时表达及效应

[目的]本文旨在评估虾青素生物合成的关键基因β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(BHY)在烟草中异源表达的活性及效应。[方法]分别构建来自莱茵衣藻(C.reinhardtii)的CrBKT和来自雨生红球藻(H.plu⁃vialis)的HpBHY酶基因的过表达载体。将含有目的基因的超表达载体应用农杆菌介导法在烟草叶组织中进行瞬时表达。PCR和生化测定目的基因表达水平、叶绿素、类胡萝卜素及虾青素含量等参数。[结果]取侵染3 d的烟叶组织,PCR检测显示CrBKT和HpBHY酶基因在异源宿主烟叶组织高效表达。取侵染5 d的烟草组织生化分析表明,HpB⁃HY+CrBKT基因共表达导致叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和虾青素含量分别达到10.33、3.012、2.271和0.518μg·mg^(-1),均显著高于对照组(P≤0.05)。单表达HpBHY基因或CrBKT基因的烟叶组织叶绿素a和叶绿素b含量显著高于对照组(P≤0.05),而类胡萝卜素和虾青素的量与对照组没有显著差异(P>0.05)。[结论]异源共表达来自莱茵衣藻(C.reinhardtii)的CrBKT和来自雨生红球藻(H.pluvialis)的HpBHY可促进虾青素和类胡萝卜素在烟叶组织的合成积累。研究为培育富含虾青素烟草新种质以及应用烟叶生物反应器高效生产虾青素提供了科学依据。

雨生红球藻虾青素合成关键酶的原核表达及纯化

雨生红球藻是天然虾青素的重要来源,在胁迫条件下积累虾青素含量能达到细胞干重的5%。八氢番茄红素合成酶(PSY)、β-胡萝卜素酮化酶(CRTW)和β-胡萝卜素羟化酶(CRTZ)是雨生红球藻虾青素合成的关键酶,本研究分别以雨生红球藻的DNA和cDNA为模板,克隆了这三个基因,并构建不同的原核表达载体pET-24a-crtw,pET-24a-crtz,pET-24a-psy。转化大肠杆菌Rosetta感受态,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和western blotting结果显示三种重组蛋白都能够正常表达,利用6×His标签对重组蛋白进行纯化能得到相对单一的条带,相对于纯化前目的条带明显加深。ELISA检测重组菌株E.coli RZ,E.coli RW,E.coli RP中的酶活性分别为3.0,10.5,10.0 IU/L,纯化后酶活性显著提高,分别为125.5,124.7,118.0 IU/L。本研究获得了这三种酶的活性重组蛋白,为其功能分析和抗体制备奠定了基础。

产虾青素酿酒酵母工程菌的构建

目的对酿酒酵母固有的β-胡萝卜素代谢途径进行扩展,构建能够合成虾青素的酿酒酵母工程菌。方法对不同来源的虾青素合成基因crt Z(β-胡萝卜素羟化酶)与crt W(β-胡萝卜素酮化酶)进行随机组合,采用overlap PCR技术构建串联表达质粒,并将其导入产β-胡萝卜素酿酒酵母工程菌内,发酵产物经HPLC和UPLC-MS鉴定,确定其成分。结果构建出8种TEF1p-crt Z-ADH1t-PGK1P-crt W-CYC1t组合的串联表达模式,其中基因组合分别为crt Z1-crt W1,crt Z1-crt W4工程菌HCCB08571、HCCB08572产生了虾青素;工程菌HCCB08566、HCCB08568、HCCB08573未检测到产物虾青素,而出现了中间产物玉米黄质和斑蝥黄质。结论成功构建了产生虾青素及其中间体的酿酒酵母工程菌。