雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮化酶是虾青素生物合成途径中关键酶之一,本研究通过基因枪法将克隆出的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt),转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中,经过含100mg/L壮观霉素固体培养基筛选得到转化子。通过PCR和基因组酶切Southern杂交分析,证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中。进一步通过RT-PCR和RT-PCR Southern杂交分析,表明bkt在衣藻转化子中得到表达。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因的cDNA和基因组DNA克隆及序列分析

根据已知的β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolase,BKT)的cDNA序列设计引物,利用长距离PCR扩增获得了bkt基因的cDNA完整编码片段及基因组DNA片段,并对这些片断进行了序列测定。cDNA和基因组DNA比对结果表明该基因至少包括5个内含子,它们的剪切位点皆符合GU-AG规律。在比对结果中同时还发现一个19bp的短序列重复,该重复序列在bkt的cDNA和基因组DNA上都发生了多次重复,推测在BKT的表达调控中可能具有一定功能。另外,在序列比对过程中还发现本实验所获得的cDNA和基因组DNA序列与前人报道的cDNA序列之间都存在多处单碱基差异和19bp的短序列差异。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析及叶绿体表达载体构建

β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶cDNA的克隆与序列分析

参照Kajiwara等人获得的β-胡萝卜素酮化酶cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增雨生红球藻的β-胡萝卜素酮化酶cDNA的完整编码片段并进行了序列测定与分析.结果表明,所获得cDNA序列与Kaji-wara等人报道序列具有96.4%的相似性,蛋白序列具有98.3%的相似性,说明所获得的cDNA序列确为β-胡萝卜素酮化酶的cDNA序列.

柑橘黄烷酮对β-胡萝卜素胶束化的影响

采用体外消化法结合细胞吸收模型,以胶束化率为指标,研究了4种柑橘黄烷酮对β-胡萝卜素胶束化的影响。结果表明,β-胡萝卜素的胶束化率随胆盐浓度升高而增加,当胆盐浓度为15 mmol/L时,添加卵磷脂能显著增加β-胡萝卜素胶束化率(p <0.05)。橙皮苷对β-胡萝卜素胶束化的促进作用显著(p <0.05),橙皮素、柚皮素次之,柚皮苷作用不显著(p> 0.05)。4种柑橘黄烷酮增加了β-胡萝卜素胶束极性,降低了胶束颗粒粒径,提高了胶束稳定性。在调控β-胡萝卜素的生物可利用率和细胞吸收方面,橙皮苷显著提高β-胡萝卜素的生物可利用率(p <0.05),橙皮苷、橙皮素、柚皮素均显著促进β-胡萝卜素的细胞吸收(p <0.05),而柚皮苷对β-胡萝卜素的细胞吸收促进作用不显著(p> 0.05)。由此可见,类黄酮的加入会提高β-胡萝卜素的生物利用率。

霍氏肠杆菌β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的制备及其应用

以霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)法扩增β-胡萝卜素9,10’双加氧酶基因,构建重组质粒,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,并采用高效液相色谱(HPLC)法检测9,10’双加氧酶活性。结果表明,通过镍柱亲和层析和分子筛Sephacryl TM S-200,得到纯化重组β-胡萝卜素9,10’双加氧酶,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,该酶分子质量约57 k Da,最适反应温度为40℃,最适反应p H值为8.5;当底物β-胡萝卜素质量浓度为500 mg/L,β-胡萝卜素9,10’双加氧酶酶活为0.4 U/m L时,β-紫罗兰酮产量为142.3 mg/L,产率达到79.4%。

四种过氧化物酶体同工酶在毕赤酵母甲醇代谢中的作用研究

利用毕赤酵母进行甲醇生物转化具有广泛的应用前景。为了深入了解该酵母甲醇代谢机理,该文以甲醇利用途径的4个过氧化物酶体同工酶为研究对象展开研究,分别为D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶2(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-2),核糖-5-磷酸异构酶2(ribose-5-phosphate isomerase,Rki1-2),转醛醇酶2(transaldolase,Tal1-2),果糖-1,6-二磷酸醛缩酶2(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba1-2)。在验证其参与甲醇代谢的基础上,分别对4个酶基因进行单敲除、四敲除,并在四敲除菌中分别进行细胞质同工酶及过氧化物酶体同工酶的回补实验。结果表明4敲除菌在甲醇培养基中受到严重的生长抑制。而单敲除菌中,Fba1-2的缺失对菌株在甲醇培养基中的生长表型影响最大;同时,回补Fba1-2也能最大程度地恢复4敲除菌株的生物量。综上,Fba1-2是甲醇同化途径中的关键酶,且同化途径的过氧化物酶体区室化对甲醇代谢途径至关重要。此外,景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,Shb17)基因单敲除菌和TAL1-2基因单敲除菌的表型对比结果表明,更改的卡尔文循环是甲醇代谢中木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate,XU5P)再生的主要途径。该研究可为后续优化毕赤酵母甲醇利用途径提供理论依据。

3-甾酮-9α-羟基化酶基因的表达及其催化合成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

研究应用于甾体9α-羟基化的高效催化剂和催化体系是实现甾体药物9α位羟基高效合成的关键。本文中,笔者对来源于分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis) SQ1的3-甾酮-9α-羟基化酶基因(reksh A,mtksh A)进行优化,并对2个基因的催化活性进行检测。通过构建工程表达菌株,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为底物,对制备9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的催化反应进行了探索。结果表明:基因序列优化显著提升了Re Ksh A和MtKshA蛋白的可溶性表达,其中Re Ksh A具有较好的雄甾-4-烯-3,17-二酮9α位羟基化活性。用TB培养基培养Re Ksh A的工程表达菌株BL21(DE3)-p ET28a-reksh A-yh,在30℃、500μmol/L底物浓度、0. 8%(体积分数)乙醇为助溶剂、0. 1 mmol/L IPTG诱导浓度、底物与诱导剂同时加入到工程菌液中的条件下,9α-OH-AD得率达到97. 09%。

锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因的生物信息学分析

类黄酮-3′,5′-羟基化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)是类黄酮代谢途径的一个关键酶,能使花色素的合成方向趋向于蓝色的飞燕草素。利用生物信息学软件对锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因(RpF3′5′H)进行分析。结果显示,RpF3′5′H基因ORF长1551 bp,共编码516个氨基酸;分子量为57.31 kD,等电点为9.03,无信号肽,定位于细胞质中的可能性最大,二级结构与三级结构中含有较多的α螺旋,与高丛越橘有较高亲缘性。分析结果将对RpF3′5′H的功能解析奠定理论基础,同时也为探究锦绣杜鹃花色苷的生物合成有一定指导作用。

荔枝核总黄酮对肝纤维化大鼠模型PPARγ/c-Ski表达的影响

目的:本研究主要观察荔枝核总黄酮(TFL)对二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化大鼠的防治效果,并从PPARγ、c-Ski等信号分子角度探讨TFL抗肝纤维化的作用机制。方法:90只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、TFL(高、中、低)剂量组和秋水仙碱阳性对照组,每组15只。空白对照组不造模,其余各组按2 mL·kg^(-1)腹腔注射0.5%的DMN溶液制作肝纤维化模型(生理盐水稀释,每周前3天,共4周);造模同时TFL高、中、低剂量组分别以TFL200、100、50 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃给药,秋水仙碱组以秋水仙碱0.1 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃给药,空白对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃,每日1次,共6周(上述灌胃药物均用适量生理盐水配置成混悬液);6周末处死大鼠,腹主动脉真空负压采血检测天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、转化因子-β1(TGF-β1)血清水平;Masson染色法观察大鼠肝纤维化程度,并进行肝纤维化半定量评分;运用免疫组化检测各组肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)和c-Ski的蛋白相对表达水平。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠血清AST、ALT、TGF-β1水平、肝纤维半定量评分和肝组织α-SMA蛋白表达均显著升高(P<0.05);PPARγ和c-Ski蛋白相对表达明显减少(P<0.05);与模型组比较,荔枝核总黄酮各组血清AST、ALT、TGF-β1水平、肝纤维半定量评分和肝组织α-SMA蛋白表达均明显减少(P<0.05);肝组织PPARγ、c-Ski的蛋白相对表达明显增加(P<0.05),且具有一定量效关系。结论:TFL能够有效地降低DMN诱导的肝纤维化大鼠的肝损伤,改善其肝纤维化的程度;其抗肝纤维化的作用机制可能是通过上调PPARγ/c-Ski表达,下调α-SMA和TGF-β1表达,抑制肝星状细胞活化来实现。

5-Aza Dc诱导孕酮受体基因启动子脱甲基化可能与DNMT_1表达下调有关

目的探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷诱导DNA脱甲基化可能机制。方法用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理白血病细胞株HL-60、K562和Jukat,分析处理前后DNA甲基转移酶1 mRNA表达和孕酮受体双启动子(PRA、PRB)甲基化状态的变化。结果5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理白血病细胞株后,PRA、PRB都发生脱甲基化作用,DNA甲基转移酶1 mRNA较处理前显著降低(P<0.01)。结论5-杂氮-2′-脱氧胞苷诱导DNA脱甲基化可能与其降低DNA甲基转移酶1 mRNA表达有关。

[2′-溴-6′-(乙氧基甲基)-3′,4′-二甲氧基-苯基]-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基-苯基)-甲酮的合成及其PTP1B酶抑制活性研究

为了寻找新型的PTP1B酶抑制剂,以香兰素(Ⅰ)为起始原料,经过溴代、傅克酰基化及亲核取代等7步反应,合成了化合物[2′-溴-6′-(乙氧基甲基)-3′,4′-二甲氧基-苯基]-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基-苯基)-甲酮(Ⅷ),总收率为21.9%。通过1HNMR、13CNMR谱及红外光谱对目标产物进行了结构表征。采用比色法对化合物Ⅷ进行了protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B)酶抑制活性测定,结果显示该化合物有一定的PTP1B酶抑制活性(化合物质量浓度为20 mg/L时,PTP1B酶抑制率为73.83%)。

杜氏盐藻β-酮酯酰-ACP合酶(DsKASⅡ)基因的分离及功能分析

酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)是催化棕榈酸(16∶0-ACP)延伸为硬脂酸(18∶0-ACP)的关键酶,其活性强弱决定着18碳脂肪酸含量的高低。本文以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为试材,分离鉴定杜氏盐藻DsKASⅡ基因编码序列,采用生物信息学工具解析DsKASⅡ酶蛋白的亚细胞定位、高级结构、理化性质及系统发育等特性。检测氮胁迫下的DsKASⅡ表达量,以及藻细胞脂肪酸、叶绿素和β-胡萝卜素的含量。结果表明,DsKASⅡ编码的酶蛋白长度为476 aa,pI为6. 99,含叶绿体靶向肽和较多亲水区。二级结构主要由α-螺旋(22. 48%),β-片层(22. 06%)和无规则卷曲(55. 46%)组成。三级结构预测表明该蛋白整体呈紧密的心形结构,活性酶蛋白为同源二聚体。系统发育分析表明,DsKASⅡ氨基酸序列与莱茵衣藻CrKASⅡ同源性达99%,可能二者有着共同的进化祖先。qRT-PCR揭示,与正常培养的杜氏盐藻相比,DsKASⅡ在氮胁迫条件下的表达量明显上调,第3天时的表达量比正常培养的高4. 5倍。氮胁迫下藻细胞总油脂、油酸(C18∶1)和类胡萝卜素含量显著提高,然而棕榈酸(C16∶0)和叶绿素的含量明显降低。这表明,氮胁迫诱导杜氏盐藻DsKASⅡ基因上调表达,将更多的棕榈酸催化为硬脂酸,进而提高了单不饱和油酸的富集以及类胡萝卜素的积累。本研究为后续进一步解析杜氏盐藻氮胁迫条件下,油脂与胡萝卜素合成积累及藻细胞响应胁迫机制和优质富油藻种培育提供了科学参考。

PPARγ配体罗格列酮对血吸虫病肝纤维化小鼠血清TNF-α和IL-6的影响

目的:检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)配体罗格列酮治疗血吸虫病肝纤维化小鼠血清TNF-α和IL-6水平的变化及意义。方法:建立血吸虫病肝纤维化小鼠模型,应用PPARγ的配体罗格列酮治疗并应用放射免疫法检测血吸虫病肝纤维化小鼠血清TNF-α和IL-6水平的变化。结果:罗格列酮治疗可显著降低肝纤维化小鼠血清TNF-α和IL-6含量,与感染对照组及吡喹酮治疗组比较差异有显著性意义(<P0·05)。结论:罗格列酮可明显降低血吸虫病肝纤维化小鼠TNF-α和IL-6水平,从而发挥其抗肝纤维化的作用。

冻结肩病理改变及过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ激动剂治疗作用的研究

背景:冻结肩是一种以肩关节疼痛和活动受限为主要特征的疾病,目前病因不明,治疗效果欠佳。目的:研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对大鼠肩关节囊纤维化及炎症反应等病理改变的影响,以及过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂对大鼠冻结肩的治疗作用,为临床治疗冻结肩提供新思路。方法:利用TGF-β1诱导人皮肤成纤维细胞(HSF)异常纤维化,PPAR-γ激动剂三萜类化合物(CDDO-IM)作为治疗药物,检测细胞增殖、迁移情况及细胞外基质蛋白的表达情况。向SD大鼠的肩关节腔注射TGF-β1过表达的腺病毒构建大鼠冻结肩模型。2周后,其中一半大鼠用罗格列酮灌胃饲养2周,作为罗格列酮治疗组。检测大鼠肩关节活动度,利用ELISA检测关节腔炎症因子,HE染色和免疫组织化学法检测大鼠肩关节囊组织细胞外基质蛋白的表达情况。结果:在细胞实验中,TGF-β1组的增殖率为83.6%,TGF-β1+CDDO-IM组增殖率为19.3%(P<0.01);TGF-β1组的迁移率为84.9%,TGF-β1+CDDO-IM组迁移率为44.1%(P<0.05);TGF-β1能够诱导HSF增殖、迁移及异常纤维化。动物实验成功构建了TGF-β1诱导的大鼠冻结肩模型,免疫组织化学结果提示,罗格列酮能够抑制大鼠冻结肩的炎症形成,减少基质蛋白生成,重塑纤维组织结构。结论:冻结肩的病理改变主要是纤维细胞异常增生,炎症细胞浸润,纤维结构紊乱,而PPAR-γ激动剂可以缓解大鼠冻结肩关节僵硬,减弱炎症反应,抑制异常纤维化。

DNA甲基转移酶活性对NNK α-亚甲基羟基化代谢的影响

为准确评价DNA甲基转移酶(DNMT)的活性对4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)通过α-亚甲基羟基化代谢途径产生O^6-甲基鸟嘌呤(O^6-mG)的影响,采用超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)方法,分别对100 mg/kg NNK染毒后的生理盐水处理组、地西他滨处理组小鼠肝脏和肺中DNMT的活性、DNA甲基化程度,以及4-(3-吡啶基)-4-氧代丁酸(OPBA)、4-(3-吡啶基)-4-羟基丁酸(HPBA)和O^6-mG的质量分数进行了测定。结果表明:(1)地西他滨能够抑制DNA甲基转移酶活性,降低DNA甲基化水平。(2)地西他滨对NNK通过α-亚甲基羟基化代谢产生OPBA和HPBA的途径无显著影响。(3)抑制DNA甲基转移酶的活性,能减少NNK通过α-亚甲基羟基化代谢产生O^6-mG的量。

黄芩总黄酮对博莱霉素致大鼠肺纤维化的干预作用

目的探讨黄芩总黄酮(total flavonoids of scutellariabaicalensis georgi,TFSB)对博莱霉素致大鼠肺纤维化的干预作用。方法气管内注入博莱霉素制备大鼠肺纤维化模型,给予TFSB灌服28 d,每天1次后,计算肺系数、测定肺组织和血清中肺纤维化部分相关生化指标,观察大鼠肺泡炎和肺纤维化程度,RT-PCR检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3 mRNA的表达水平,Western blot检测平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)与过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPAR-γ)的蛋白表达水平。结果与模型组相比,TFSB各剂量组大鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)含量、血清与肺组织匀浆中丙二醛(MDA)含量降低(P<0.05,P<0.01),血清与肺组织匀浆中谷胱甘肽(GSH)含量、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、血清总抗氧化能力(T-AOC)升高(P<0.05,P<0.01),TFSB各剂量组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度降低(P<0.01),RT-PCR和Western blot结果显示:TGFβ-1、Smad2、Smad3 mRNA的表达水平升高(P<0.05),α-SMA蛋白表达水平降低(P<0.05),PPAR-γ蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论 TFSB对博莱霉素致大鼠肺纤维化有一定的防治作用,其机制可能与机体内的抗氧化和下调TGF-β1信号通路有关。

溪黄草黄酮对小鼠非酒精性脂肪肝纤维化的影响及其机制探讨

目的观察不同浓度溪黄草黄酮(FRSH)对非酒精性脂肪肝纤维化小鼠的影响,并探讨初步机制。方法将小鼠随机分为5组:对照组、模型组及FRSH低、中、高剂量组(FRSH-L、FRSH-M、FRSH-H)。检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷氨酸氨基转移酶(AST)水平;苏木精-伊红染色法观察肝脏组织的病理状态;Western blot检测肝组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肝组织中转化生长因子-β(TGF-β)、过氧化物酶体增殖物活化受体-γ(PPARγ)mRNA的表达。结果与模型组比较,FRSH能够降低血清中ALT、AST的含量,并改善肝组织的脂肪变性,减轻炎症、坏死程度;肝组织中TIMP-1蛋白和TGF-β mRNA表达降低,MMP-9蛋白和PPARγ mRNA表达增加。结论 FRSH能抑制非酒精性脂肪性肝纤维化的发生、发展,可能与MMP-9、TIMP-1、TGF-β及PPARγ的表达相关。

黄芩茎叶总黄酮对实验性大鼠肝纤维化的影响

目的 :研究黄芩茎叶总黄酮 (SSTF)对四氯化碳诱导的实验性大鼠肝纤维化的影响 ,并探讨其作用机制。方法 :6 0只大鼠随机分为 5组 ,正常组、模型组、SSTF(17 5mg/kg、35mg/kg、70mg/kg) 3个剂量保护组 ,采用四氯化碳 (CCL4)皮下注射 8周制备大鼠慢性肝纤维化模型 ,用SSTF灌胃给药 ,每天 1次 ,连续 8周 ,8周末处死全部大鼠。常规生化方法检测肝功能和肝组织Hyp含量 ,免疫组化检测肝组织转化生长因子 - β1(TGF - β1)和α -平滑肌肌动蛋白 (α-SMA)表达。H E染色和Van -Gieson染色观察肝组织病理形态学改变。结果 :SSTF保护组肝纤维化程度显著低于模型组 ,血清ALT活性和肝组织HYP含量明显减少 (P <0 0 5 ) ;CCL4诱导肝纤维化肝组织中TGF - β1、α-SMA表达增加 ,给予SSTF保护后可明显抑制肝组织中TGF - β1、α -SMA蛋白的表达。结论 :SSTF能有效减轻大鼠肝脏损伤和肝纤维化的形成 ,其机理可能是通过抑制TGF - β1在肝内的表达和星形细胞的活化 ,从而抑制了细胞外基质在肝脏的分泌和沉积 ,达到抗肝纤维化作用。

氢化可的松对大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响

目的 研究氢化可的松对体外培养的大鼠睾丸间质细胞 (Leydigcells)睾酮分泌的影响 ,探讨氢化可的松影响睾酮分泌的作用机制。方法 将雄性大鼠处死 ,取睾丸间质细胞悬液分别加入氢化可的松、促性腺激素、雄烯二酮进行体外培养 ,用放射免疫分析方法测定睾酮含量。结果 氢化可的松可抑制促性腺激素刺激的睾酮分泌 ,但对睾酮的基础分泌及雄烯二酮升高的睾酮水平无影响。结论 在睾丸间质细胞 ,氢化可的松以剂量依赖性方式抑制促性腺激素刺激的睾酮的合成 ,但对细胞中