碳源对假单胞菌NX-1产生L-天冬氨酸β-脱羧酶的影响

比较了假单胞菌 NX- 1在各种糖类物质、有机酸和氨基酸培养基上生长和合成 L -天冬氨酸β-脱羧酶(ADL )的情况 ,结果表明用不同的碳源培养基 ,NX- 1的生长和产酶表现出明显的差异。 NX- 1能利用糖类物质生长 ,但 ADL合成受阻遏。三羧酸循环中间体是 ADL合成的良好的碳源 ,谷氨酸是 ADL酶合成最好的诱导剂 ,其诱导合成的 ADL是富马酸为碳源时的 2倍。对 L -谷氨酸 (L - Glu)刺激 ADL酶生成的机理进行初步分析 ,认为 L - Glu通过自身 (而不是由 L - Glu衍生出的任何代谢物 )和 ADL合成的有关基因作用强烈诱导

L-天冬氨酸-β-脱羧酶发酵条件的响应面优化

利用Plackett-Burman设计和响应面分析方法对L-天冬氨酸-β-脱羧酶产生菌德阿昆哈假单孢菌XG-2-81的发酵条件进行优化。得出影响产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的3个重要的因素为:玉米浆,多肽朊和装液量。通过对实验结果的方差分析,得到其最适条件分别为:玉米浆浓度0.64%,多肽朊浓度1.21%,装液量14.71%,此时酶活力达到1 107μg/mL·h,比优化前提高了10.83%。

利用假单胞菌天冬氨酸-β-脱羧酶高效生产L-丙氨酸

通过诱变筛选得到一株具有高活性Ｌ－Ａｓｐ－β－脱羧酶的菌株ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＮＸ－１，对该株酶形成和酶反应的条件进行了详细研究，该株可以高效地转化Ｌ－Ａｓｐ生成Ｌ－ＡＩａ，转化４～５山每Ｌ培养液可转化Ｌ－Ａｓｐ量高达１４００ｇ左右，生成Ｌ－Ａｌａ浓度高达９０％以上，摩尔转化率近１００％。

重组表达天冬氨酸-β-脱羧酶及其酶学性质

利用p ETDuet-1为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)来源的天冬氨酸-β-脱羧酶(Asd),研究了其酶学性质,考察了p H、p H稳定性、温度、热稳定性、底物浓度对酶活的影响。结果表明,天冬氨酸-β-脱羧酶重组表达成功;最适反应温度和p H分别为45℃和6.0;动力学常数Km和Vmax分别为0.72 mmol/L和10.52 mol/(L·min·g)。0.1 g菌体细胞在10 m L 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液中催化2.0 g L-天冬氨酸,40℃,p H=6.0反应15 h,L-天冬氨酸的摩尔转化率达到98.6%。

不动杆菌来源L-天冬氨酸-β-脱羧酶的表达与酶学性质分析

L-天冬氨酸-β-脱羧酶(L-aspartate-β-decarboxylase,Asd)催化L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸,该研究对Acinetobacter radioresistens来源的Asd酶进行酶学性质解析,为工业生产L-丙氨酸提供参考。构建表达质粒pET28a-ArAsd,转化大肠杆菌E. coliBL21(DE3)实现ArAsd基因的异源表达。利用亲和层析纯化获得携带His标签的纯酶后进行酶学性质研究,并考察重组菌底物、产物耐受的能力。结果表明,重组酶比酶活力为753 U/mg,其最适催化温度为55℃,最适反应pH为4. 5,在40~45℃、pH 6. 0~7. 0条件下较稳定,45℃处理3 h酶活力剩余70%左右,pH 7. 0处理12 h酶活力剩余90%左右。产物L-丙氨酸浓度超过500 mmol/L时重组菌细胞酶活力有明显降低,底物L-天冬氨酸对重组菌细胞催化活性有促进作用。该研究首次在E. coli中异源表达Acinetobacter radioresistens来源Asd酶,其比酶活力高于目前已有报道的Asd酶,具有一定的工业应用潜力。

重组L-天冬氨酸-β-脱羧酶融合蛋白复性条件的研究

以本实验室构建保存的天冬氨酸脱羧酶工程菌为研究材料,通过基因表达,对所得到的重组胞内融合表达型天冬氨酸脱羧酶蛋白进行体外复性研究,考察温度、复性液的pH、复性时间、复性液种类等因素对重组天冬氨酸脱羧酶体外复性的影响。结果表明:最佳复性液为pH8.7的Tris-HCl缓冲液,在保温时间2h,温度40℃下,复性效果最好。另外一些pH能达到8.7的缓冲液复性效果都不如Tris-HCl缓冲液。

L-天冬氨酸脱羧酶研究进展

根据作用于L-天冬氨酸的位置不同,L-天冬氨酸脱羧酶可分为L-天冬氨酸α-脱羧酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶,本文综述了两种酶在结构特点、酶学性质、基因表达、酶的应用等方面的研究进展。

提高天冬氨酸β-脱羧酶在酸性环境中催化活力的分子改造

克隆了德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶基因(Asd),实现其在Escherichiacoli中的异源表达,但该酶在酸性环境中活性较低,不利于工业生产.为通过定点突变技术提高该酶在酸性环境中的活力,选择底物通道区域内的5个氨基酸残基作为突变位点,构建6个突变体,随后分析突变体的酶学特性.结果表明,相比于野生型Asd,大多数突变体的比酶活显著下降,只有突变体N34D比酶活(71.67 U/mg)比野生型(65.95 U/mg)略高;另外,突变体N34D在3.5 <pH <5.5酸性环境中的酶活力与野生型Asd相比均得到了提高,其中pH5.0条件下突变体N34D相对酶活达到82%,而野生型Asd相对酶活只有50%左右;而在pH 5.5-8.5范围内突变体N34D的酶活力与野生型相当.最后将突变体N34D应用于催化合成L-丙氨酸,在最适催化条件(pH 5.5)下,突变体N34D催化合成L-丙氨酸的产量是野生型Asd的1.5倍.本研究通过对德阿昆哈假单胞菌来源的N34位点进行突变,成功提高了天冬氨酸β-脱羧酶在酸性环境中的酶活力,并提高了其合成L-丙氨酸的能力,这对酶法生产L-丙氨酸具有重要的指导意义.

L－天冬氨酸β－脱羧酶高活力菌株的培养

为了获得较高的Ｌ－天冬氨酸β－脱羧酶活力，选用ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄａｃｕｎｈａｅＣＰＵ９００１菌株进行培养，在含有１．５％Ｌ－谷氨酸盐，０．５％富马酸铵，１％富马酸钠，３．０％玉米浆，２％蛋白陈，０．０５％ＫＨ２ＰＯ４和０．０１％ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ｐＨ７．０～７．５的培养液中３０℃发酵２８ｈ，Ｌ－谷氨酸盐有益于Ｌ－天冬氨酸β－脱羧醇的增加。

重组大肠杆菌转化富马酸生产L-丙氨酸

通过克隆来源于睾丸酮丛毛单胞菌的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因,在一株具有L-天冬氨酸酶生产能力的大肠埃希氏菌CICC 11022S中异源表达,构建转化富马酸生产L-丙氨酸的重组工程菌。结果发现:重组工程菌9 h转化富马酸产生112.7 g/L的L-丙氨酸,生产速率12.5 g/(L·h),转化率93.8%。富马酸价格较低,有效降低L-丙氨酸生产的原料成本。通过构建重组工程菌,以富马酸为底物,高效生产L-丙氨酸,结果表明该方法具有较好的工业应用潜力。

生物拆分法制备D-天冬氨酸

[目的]利用L-天冬氨酸-β-脱羧酶生物转化拆分DL-天冬氨酸得到D-天冬氨酸的工艺过程。[方法]研究了碳源、有机氮源、转化过程pH值和转化温度对发酵液L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活力的影响,探讨了L-天冬氨酸-β-脱羧酶的热稳定性及L-丙氨酸对L-天冬氨酸-β-脱羧酶热稳定性的影响,并测定了拆分产物的主要指标。[结果]糖类对该酶的生物合成有明显的阻遏作用,而富马酸和苹果酸是很好的碳源物质。有机氮源中蛋白胨浓度对发酵液酶活力的影响较大,当牛肉膏浓度为0.2%,玉米浆为1.0%,蛋白胨为1.0%时发酵液酶活力可以达到最高。转化过程最适pH值为6～7。转化过程最适温度50℃。温度超过60℃酶失活比较严重。浓度6.0%以上的丙氨酸能显著提高转化过程中酶的热稳定性。[结论]利用D-天冬氨酸和L-丙氨酸的等电点的差异来分离提取D-天冬氨酸的制备工艺,其工艺简单,原料价格适宜,提取方便,工艺路线要比其他方法更便捷,更容易产业化。

紫外和He-Ne激光复合诱变筛选L-丙氨酸高产菌株

对L-丙氨酸产生菌德阿昆哈假单孢菌分别进行紫外、激光以及紫外—激光的复合诱变筛选,结果表明,复合诱变正突变率幅度较大.从紫外—激光的复合诱变得到的突变株中筛选到3株遗传性状稳定的高产菌株,其L-天冬氨酸-β-脱羧酶的活性较之出发菌株分别提高19.97%、30.04%和26.55%,经9次传代培养,突变株性质稳定.