金露梅中一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取富集及活性研究

本研究采用AB-8大孔吸附树脂、半制备高效液相色谱对金露梅枝叶中槲皮素-7-O-β-D-葡糖苷酸提取分离,并通过13 C NMR鉴定其化学结构,最后采用以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物的酶抑制剂筛选模型检测其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性和类型。结果显示:槲皮素-7-O-β-D-葡糖苷酸分布在20%乙醇大孔吸附树脂(AB-8)洗脱液中,采用半制备高效液相色谱和高效液相色谱分离纯化得槲皮素-7-O-β-D-葡糖苷酸2481.8 mg,纯度为97.95%。活性检测结果表明,槲皮素-7-O-β-D-葡糖苷酸对α-葡萄糖苷酶的最大抑制率为94.67%,IC 50为0.259 mmol/L,抑制率显著高于阳性对照药物阿卡波糖,且抑制剂类型为竞争性抑制。

大豆启动功能片段的克隆及在转化甘草中启动β-葡糖苷酸酶基因的表达

将大豆DNA的HindⅢ和BamHⅠ酶切片段连接到pBⅠ101载体缺启动子的GUS基因上游,构建了含有不同DNA片段的重组质粒,转化大肠杆菌C600,获得了具Km抗性的转化子。通过三亲交配将上述重组质粒转移至发根农杆菌R1000(PRiA4b)中,用注射法,将各含重组质粒的发根农杆菌菌液感染甘草外植体,在含cb的无激素MS培养基上诱发毛状根并再生成植株。转化甘草具Km抗性,有甘露碱和农杆碱存在。经组织化学法检测,在转化株C2和C13的毛根、茎、叶中有靛蓝色沉淀物产生。证明大豆启动功能片段在转化甘草中启动了GUS基因表达。重组质粒的酶切分析证明C2和C13大豆DNA插入片段均约为0.8kb。DNA分子杂交也证明C2、C13 DNA与大豆DNA和转化株DNA有同源性。

头颈部恶性肿瘤患者β-葡萄糖苷酸酶活性的检测

研究头颈部恶性肿瘤患者上呼吸道分泌物和血清中β－葡萄糖着酸酶（beta－glu－curonidase，β－GD）活性变化。采用微量比色法检测头颈部恶性肿瘤患者、健康人和头颈部良性疾患者各40例上呼吸道分泌物和血清中β－GD活性，并进行对比研究。结果表明：三级血清中β－GD活性差异无显著性；上呼吸道分泌物中β－GD活性在健康人群组与良性疾患组间差异亦无显著性，而恶性肿瘤组则明显升高，与前两级相比，差异有极显著性（P＜0．001），若以正常对照组的均数加两个标准差为阳性判断标准，则敏感性、可靠性和特异性分别为85．0％、92．5％和100％。晚期、有淋巴结或远处转移者β－GD活性较早期、未发生转移者升高更明显。对6例恶性肿瘤患者治疗前后上呼吸道分泌物中β－GD活性进行一年的动态监测，其变化气临床症状相一致。实验结果提示上呼吸道分泌物中β－GD活性的检测可作为头颈部恶性肿瘤早期诊断、临床分期分级、疗效评估及判断肿瘤有无复发或转移的有价值的辅助指标。

类风湿性关节炎患者的白细胞β-葡萄糖苷酸酶活性的变化

对35例类风湿性关节炎(RA)患者及35例正常人的白细胞中β-Ga的活性及治疗前后的变化进行了测定,并将活动性RA和非活动性RA进行了比较,结果表明RA组的β-Ga的活性明显高于正常人组,经过治疗后RA患者的β-Ga活性明显降低。且β-Ga活性与ESR呈正相关。因此,β-Ga活性高低可以作为RA的诊断与鉴别活动性RA和非活动性RA的一个重要参考指标。

农杆菌介导β-葡糖苷酸酶基因转化巴戟天的研究

【目的】建立一套农杆菌转化巴戟天的有效方法,为巴戟天新品种选育、引入外源目的基因奠定基础。【方法】以巴戟天带节茎为材料,工程农杆菌菌株为EHA101,Ti质粒上插入了β-葡糖苷酸酶(GUS)、新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因。【结果】将巴戟天带节茎进行遗传转化,头孢霉素用作抑菌剂,浓度为300mg·L^(-1)。外植体与农杆菌共培养时间以3d最好。卡那霉素作为选择试剂,浓度为50mg·L^(-1) 。CUS基因瞬时表达检测,70.5％的外植体呈阳性反应;GUS基因稳定表达检测,抗性植株中GUS反应呈阳性所占比例为22.2％。【结论】农杆菌介导GUS基因转化巴戟天的研究可为建立有效的中药遗传转化系统奠定方法学的基础。

β-葡糖苷酸酶测定用基质的制备方法改进及其临床应用

β-葡糖苷酸酶(β-Glucuronidase,β-G)是一种酸性水解酶,可催化多种β-葡萄糖苷酸盐,最适pH为3.8～6.8,对低温及热稳定性较好。因在肿瘤组织中含量较高而用作肿瘤的诊断指标。我们对其基质——酚肽葡糖苷酸异辛可宁碱的生物合成、纯化及配制作了改进,使其简便易行,报道如下。

固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备及其在4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇的O-糖苷化合物分析中的应用

采用溶胶-凝胶法,以丙烯酰胺作为单体,制备了基于有机-硅胶杂化整体柱的β-葡萄糖醛酸酶反应器。优化了硅酸甲酯和γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅的物质的量的比、丙烯酰胺和聚乙二醇的用量,以及水浴温度等制备条件,获得了孔隙均匀、通透性良好、机械强度高的有机-硅胶杂化整体柱。采用光学显微镜和扫描电镜表征杂化整体柱。进一步将β-葡萄糖醛酸酶共价键合在整体柱上,以4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇(NNAL)的O-糖苷化合物(NNAL-O-Gluc)为底物研究酶反应器的水解效果,实验结果证明酶反应器在室温条件下的水解效率大大提高,实现了NNAL-O-Gluc高效水解与分析,解决了目前NNAL-O-Gluc分析中前处理水解效率低的问题。

亚洲人群尿苷二磷酸葡糖苷酸转移酶1A1*6基因多态性与伊立替康相关毒性的系统评价和meta分析

系统评价尿苷二磷酸葡糖苷酸转移酶1A1(UGT1A1)*6基因多态性与伊立替康致严重腹泻和中性粒细胞减少的关系。方法 计算机检索PubMed、EMBase、CNKI等数据库,收集亚裔UGT1A1*6 基因多态性与伊立替康致严重腹泻和中性粒细胞减少的相关研究,对符合纳入标准的研究进行资料提取和质量评价,采用Rev Man 5.3 软件进行Meta 分析。结果 共纳入31项观察性队列研究,总计3605例患者。meta分析显示,携带UGT1A1*6患者严重腹泻及严重中性粒细胞减少发生风险显著增加。 亚组分析提示:伊立替康低、中剂量时,携带UGT1A1*6患者严重腹泻及严重中性粒细胞减少发生风险增加;伊立替康高剂量时,携带UGT1A1*6患者发生严重中性粒细胞减少风险无明显相关。结论 伊立替康在<200 mg/m2剂量使用时, UGT1A1*6 突变基因均会增加肿瘤患者发生严重腹泻和中性粒细胞减少风险;>200 mg/m2时,UGT1A1*6基因多态性与严重中性粒细胞减少风险无明显相关。

长期施肥土壤β-葡糖苷酶动力学特性研究

以长期施肥的黑土和棕壤为供试对象,对土壤β-葡糖苷酶动力学特性进行研究.结果表明,土壤β-葡糖苷酶的酶促反应符合一级动力学模型.黑土有机肥处理对土壤β-葡糖苷酶动力学参数影响较大,Km和Vmax值均高于单施化肥和对照处理;与对照相比,化肥处理影响较小.棕壤施用化肥后,Km和Vmax值与其他处理相比均减小,有机肥处理后Vmax和Vmax/Km值增大.2种土壤各施肥处理β-葡糖苷酶的Vmax值与土壤有机质、全氮含量均呈显著正相关关系,并对施肥处理的响应较敏感.

不育患者精浆中性α-1,4-糖苷酶活性与精液参数及精子透明质酸酶活性的关系

目的探讨精浆中性α-1,4-糖苷酶(α-1,4-G)活性与精液参数及透明质酸酶(HYD)活性(HYD阳性反应率及HYD活性强度)之间的关系。方法收集52例24~40岁不育患者及12名正常对照者(正常生育组)精液。采用以精子质量分析仪对每份标本进行临床精液常规检查及计算机辅助精液分析;运用酶法测定精浆中性α-1,4-G活性;采用改良固定底物膜法分别检测精子顶体内HYD阳性反应率及HYD活性强度。根据中性α-1,4-G活性检测结果将不育患者分为中性α-1,4-G活性正常组(简称酶活性正常组,39例)和中性α-1,4-G活性异常组(简称酶活性异常组,13例)。结果精浆中性α-1,4-G活性与精子密度、精子活动率、HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)呈正相关(r值分别为0.816、0.890、0.872和0.847,P均<0.01);与畸形精子率呈负相关(r=-0.579,P<0.01)。不育各组中精子密度、精子活动率和HYD活性(HYD阳性反应率及HYD活性强度)均明显低于正常生育组(P<0.01);酶活性异常组的畸形精子率高于酶活性正常组(P<0.01)。结论精浆中性α-1,4-G活性对精子密度、精子活动率、畸形精子率和HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)均有明显影响。

pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的酶催化动力学模型

pH值是影响酶催化反应速率的重要因素之一,建立动力学模型有助于定量分析酶解反应。经典的“三状态”动力学模型未考虑pH值对底物解离状态的影响及产物抑制的作用,该文对“三状态”动力学模型进行改进。在一系列假设基础上提出绿色木霉产纤维素酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的反应机理,建立了pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的动力学模型,推导出反应速率表达式。Lineweaver-Burk作图法求得内切β-葡聚糖苷酶水解CMC-Na在不同pH的动力学参数:K′m和V′max,试验最佳初始pH值与模型计算pH值符合,从而模型得以验证。

利用瞬间表达技术分析小麦几丁质酶和β-1,3葡聚糖苷酶基因的抗病性功能

几丁质酶基因和-β1,3葡聚糖苷酶基因是植物抗病反应过程中的两类重要的病程相关蛋白(PR)基因。为了快速准确地评价此类基因组成性表达后的抗病效果及在分子育种上的应用价值,利用瞬间表达技术分别在感病小麦品种离体叶片表皮细胞中过量表达1个小麦几丁质酶基因Cht4和2个小麦-β1,3葡聚糖苷酶基因G lb3s2和G lb3s6,并以GUS基因的共表达标识阳性转化细胞。基因枪轰击后高密度接种白粉病菌孢子,40h后观察转化阳性表皮细胞及其表面孢子的发育,并以阳性转化细胞中白粉病菌成功侵入的细胞所占比例(侵入频率)为指标分析目标基因的表达对白粉病菌入侵及吸器形成产生的影响(对照为单独导入GUS基因的表皮细胞)。结果表明,小麦几丁质酶基因Cht4(侵入频率为18.3%,对照为25.04%)和小麦-β1,3葡聚糖苷酶基因G lb3s2(侵入频率为19.63%,对照为24.63%)在感病小麦品种叶片表皮细胞中的瞬间表达,对白粉病菌侵入和吸器形成均有抑制作用,在一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性。

重组β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因在大肠杆菌中的共表达

β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖苷酶是纤维素酶的重要组分，多基因的共表达在各领域有重大的应用价值，本研究利用pET32a和pET30b两个载体的不同抗性的特性，在大肠杆菌中将β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因，实现了不相容性共表达，获得了产两种酶的工程菌，酶活力可达1196．8U／mL。比单一酶组分的酶活力高，酶学性质分析显示共表达酶的最适反应pH为6．0，最适反应温度60℃，在pH5-7范围内能保持较高活性，酶活可达最高酶活的80％以上，在30～60％范围能有较高的温度稳定性，酶活维持在80％以上。这一结果将为工业应用的进一步研究提供理论基础。

茉莉酸甲酯对人参β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性的影响

为了明确β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导人参抗人参锈腐病过程中的作用,试验设4个处理:MeJA、Cylindrocarpon destructans、MeJA+Cylindrocarpon destructans和CK。MeJA浓度为200 mg/L。处理后3,6,9,12,15,20,25,30天测定酶活。结果表明,经MeJA处理后接种人参锈腐菌,人参根系β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性均较对照增强。β-1,3-葡聚糖酶活性在第12天达到峰值,是对照的1.39倍;几丁质酶活性在第15天达到峰值,是对照的1.51倍。这表明β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在MeJA诱导人参抗人参锈腐病的过程中起重要作用。

人精浆中性α-1,4-糖苷酶活性与精子透明质酸酶活性的关系

目的探讨人精浆中性α-1,4-糖苷酶(中性α-1,4-G)活性与精子透明质酸酶(HYD)活性(HYD阳性反应率及HYD活性强度)的关系。方法收集年龄24～40岁不育男性精液38例,正常对照12例,根据精浆中性α-1,4-G活性检测结果分为2组:精浆中性α-1,4-G活性正常组(26例)和精浆中性α-1,4-G活性异常组(12例)。24～40岁正常生育男性精液12例作为对照组。用检测盒测定中性α-1,4-G活性,用改良固定底物膜法分别检测精子顶体内HYD阳性反应率及HYD活性强度。结果不育各组中的精浆中性α-1,4-G活性和精子HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)均显著低于正常生育组(P<0.01)。精浆中性α-1,4-G活性与HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)呈显著正相关(r=0.877,r=0.910;P<0.01)。结论精浆中性α-1,4-G活性对精子HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)有明显影响。

当归浓缩丸提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

目的:从当归浓缩丸中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂.方法:利用冷浸得到当归浓缩丸水提物;取部分水提物经醇沉后,浓缩上清液得到其流浸膏;从其水提醇沉中得到粗当归多糖.体外实验观察了当归浓缩丸三种提取物对α-葡萄糖苷酶活力的影响,有效成分鉴定以及当归浓缩丸流浸膏的动力学类型.结果:当归浓缩丸流浸膏对α-葡萄糖苷酶有抑制作用,呈量效关系,氨、α-萘酚反应阳性;其流浸膏对该酶抑制类型为竞争性抑制.结论:当归浓缩丸流浸膏对该酶活力抑制作用可能与含黄酮苷类化合物有关.

一株绿色木霉产外切β-葡聚糖苷酶条件及其纯化与性质的研究

从树林中腐烂木块上采集并筛选出一株分泌外切β葡聚糖苷酶(exo1,4βD glucanaseorcellobiohydrolase,CBH)的绿色木霉菌株.在100mL的锥形瓶中装入40mL培养基的产酶状况最好,其通气量最佳,培养液初始pH为8时绿色木霉产生的CBH活力最高.随绿色木霉生长时间的延长,CBH的活力与培养基中的葡萄糖含量呈交替的一高一低的波浪状变化.通过硫酸铵分部分离、葡聚糖G100凝胶过滤、DEAE纤维素52阴离子交换柱层析等方法使绿色木霉所产的CBH达到了电泳纯,纯化倍数为16.3.CBH的反应最适温度为60℃,最适pH为6.0,Km(底物为羧甲基纤维素钠)为17.34mg/mL.

绿色木霉MJ1产内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用KTAUPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后酶的比活力提高了28·6倍,回收率为19·7%。SDS-PAGE后经BIO-RAD凝胶成像系统分析该内切酶的分子量为64·7kD。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度53℃,最适pH为4·2,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为1·230×10-2g/mL、2·396×10-2mg/(mL·min)。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为2·2mmol/L时分离效果达到最佳。

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。

康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

康氏木霉GIMP3.444经摇瓶发酵,获得分泌到胞外的纤维素酶,粗酶液经(NH4)2SO4分级沉淀、Sephacryl S200凝胶过滤层析、DEAE Sepharose FF离子交换层析及Octrl Separose CL-4B疏水层析分离纯化出一种内切型的β-葡聚糖苷酶,SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,BIO-RAD分析相对分子量为61.8 ku。该内切β-葡聚糖苷酶的最适反应温度为55℃,最适反应p H值为4.4,作用于羧甲基纤维素钠时,Lineweaver-Burk法求得Km、Vmax分别为4.81 mg/m L、2.48 mg/(min·m L)。