HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷体外对膀胱癌EJ细胞杀伤作用的研究

目的本实验将鼠源性免疫球蛋白G1(以下简称HMFG1)与β-葡萄糖苷酶连接,研究HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷在体外特异性杀伤人膀胱癌细胞(以下简称EJ细胞)的作用,探讨HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷用于膀胱癌治疗的前景。方法将不同浓度的苦杏仁苷加入HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物、HMFG1单抗、HMFG1单抗加β-葡萄糖苷酶中,作用于EJ细胞,采用四氮噻唑蓝比色法(以下简称MTT法)与水溶性四唑盐比色法(以下简称WST-8法)进行实验。结果在不同方法下,不同苦杏仁苷浓度的HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物对EJ细胞的杀伤活性吸光度值与其他组比较,差异有统计学意义(P<0.01);在不同方法下,各组对EJ细胞的抑制率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。偶联物在250 mmol·l-1浓度下,MTT法IC50为2.12 mmol·l-1、WST-8法IC50为1.17 mmol·l-1。结论本实验证明HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷具有明显特异性杀伤EJ细胞的作用,HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷可能成为治疗膀胱癌的有效策略,可以进入动物实验进行进一步验证。

利用重叠PCR法克隆里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因cel1a

在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和大宗化学品的工业生产过程中,降解纤维素为葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的活性及其表达时起到至关重要的双重作用。为了研究β-葡萄糖苷酶Cel1a在里氏木霉Rut C-30中对纤维素酶诱导表达及其酶活性的影响,以里氏木霉的基因组DNA为模板,设计扩增看家基因(β-actin)的启动子(Pact)和cel1a的引物,分别进行Pact、cel1a的PCR扩增,然后利用重叠PCR将Pact、cel1a连成1个片段Pact-cel1a,再通过酶切成功地将Pact-cel1a片段连接到p CAMBIA1300二元质粒上,从而为后续研究β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活性及其表达过程中的作用奠定了基础。

葡萄果实β–葡萄糖苷酶基因克隆、原核表达及活性检测

以‘玫瑰香’葡萄着色期的果肉为试材,通过反转录技术克隆了ABA合成相关酶β–葡萄糖苷酶基因VvBG1的1 518 bp编码区核苷酸序列,其编码1个含有505氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,VvBG1含有1个跨膜区和糖基水解酶1超家族保守域。通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶将除去信号的编码区克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),成功诱导并纯化了VvBG1融合蛋白。经过透析复性和超滤浓缩得到了0.8 mg.mL-1可溶的融合蛋白。通过纯化蛋白葡萄果肉均浆液孵育试验和GC–MS ABA含量分析证实了葡萄果实中β–葡萄糖苷酶VvBG1具有较高的生理活性。