青果不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

目的:探究青果不同溶剂提取物的成分差异及对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。方法:使用水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇对青果进行提取,分别测定不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,明确其抑制类型,并检测不同提取液中没食子酸、鞣花酸、总黄酮含量。结果:各溶剂提取物均对α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用,其抑制类型为可逆性非竞争性抑制作用;70%乙醇提取物抑制效果最佳,半抑制浓度(IC50)为9.914×10^(3)µg/mL,没食子酸、鞣花酸、总黄酮含量分别为(5.33±0.03)mg/g、(12.61±0.12)mg/g、(19.05±0.02)mg/g。结论:青果提取液成分中没食子酸对提取溶剂不敏感,鞣花酸及总黄酮水溶性不佳;对α-葡萄糖苷酶的抑制效果总体以70%乙醇提取液最佳,酶抑制率最高,此为青果开发提供了依据。

不同干燥条件下黄芩主要成分含量及β-葡萄糖醛酸苷酶活性变化规律研究

[目的]揭示黄芩药材在不同干燥条件下主要成分及β-葡萄糖醛酸苷酶活性的变化规律,探究黄芩药材产地加工的适宜方法。[方法]制备不同干燥条件下的黄芩药材样品,研究干燥过程中黄芩药材样品的失水率、主要成分的含量及β-葡萄糖醛酸苷酶活性。[结果]不同干燥条件下黄芩药材中主要指标成分含量基本一致,黄芩苷含量均符合2020年版《中国药典》规定;随着干燥温度升高,药材中β-葡萄糖醛酸苷酶活性明显降低。[结论]不同干燥方式对黄芩主要成分含量影响较小,温度升高有效灭活黄芩药材中的β-葡萄糖醛酸苷酶,为黄芩产地加工提供了参考。

没食子酸衍生物抑制α-葡萄糖苷酶的机理研究

为明确没食子酸及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的影响,采用紫外分光光度法、荧光光谱法和分子对接技术分别对没食子酸及其酯化衍生物与α-葡萄糖苷酶相互作用的情况进行了分析.结果表明:没食子酸(IC_(50)为9.80 mg·mL^(-1))、没食子酸甲酯(IC_(50)为6.16 mg·mL^(-1))、没食子酸乙酯(IC_(50)为2.97 mg·mL^(-1))和没食子酸丙酯(IC_(50)为1.00 mg·mL^(-1))均具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制能力;没食子酸及其衍生物均会静态猝灭α-葡萄糖苷酶的内源荧光,不同温度下结合常数K_(a)均超过10~5 L·mol^(-1),结合位点n≈1,相互作用的主要驱动力为氢键和疏水作用力,表明酯基的存在能强化没食子酸与α-葡萄糖苷酶的结合,但随着酯基的延长,分子间的空间位阻增加,相互作用的概率下降;没食子酸衍生物能够改变酶的构象,有效增强α-葡萄糖苷酶的色氨酸(Trp)残基和酪氨酸(Tyr)残基所在微环境的极性;没食子酸及其衍生物结合于α-葡萄糖苷酶的同一个疏水口袋内,主要与Ser 288,Ile 523和Lys 776通过氢键结合.综上所述,没食子酸及其衍生物可以结合α-葡萄糖苷酶的特定位点,通过改变微环境、酶构象等可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性,以期为筛选或改造高活性α-葡萄糖苷酶抑制剂提供理论基础.

腐乳酸浆水中产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的研究

桂林腐乳酸浆水是桂林腐乳制作过程中的凝固剂,其富含的微生物赋予了腐乳特有的品质。而桂林腐乳酸浆水中乳酸菌的种类及其具有的优良功能活性尚不清晰。该研究从酸浆水中筛选出10株乳酸菌,其中5株具有产β-葡萄糖苷酶能力。经生理生化和16S rRNA鉴定,a1、a3、a7和b16为利莫西发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum),b8为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)。b8展现出最高的β-葡萄糖苷酶活力(发酵6 h时为(41.22±0.47)U/105 CFU),生长活力和产酸能力也显著高于其余4株产酶乳酸菌(P<0.05)。此外,德氏乳杆菌b8在培养12 h时的DPPH、ABTS自由基清除率分别为(16.29±2.22)%、(51.02±2.43)%。综上,德氏乳杆菌b8具有较好的功能活性和生长活力,该研究既丰富了对桂林腐乳酸浆水中乳酸菌的认识,又为豆制品行业提供了潜在的功能性发酵菌株。

Aspergillus sp.DLCS-F18胞外嗜热嗜酸β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究

β-葡萄糖苷酶作为纤维素彻底降解为葡萄糖的关键酶,被广泛运用于饲料、食品和生物燃料等行业。然而,许多菌株分泌的胞外β-葡萄糖苷酶活性低且热稳定性差,限制了其在纤维素生物质降解中的应用。本研究使用稻草秸秆作为碳源诱导菌株Aspergillus sp.DLCS-F18分泌胞外β-葡萄糖苷酶。结果表明:其最适反应pH和温度分别为4.0和60℃,在55℃和60℃下,孵育120 min后仍能保持95%以上的相对活性。此外,其表现出对金属离子的耐受性,在10 mmol/L的Ni^(2+)、Co^(2+)、Pb^(2+)和Cu^(2+)存在时,仍保持75%以上的相对活性,发酵96 h达到最高活性(2.5±0.1)U/mL。以上结果表明Aspergillus sp.DLCS-F18胞外β-葡萄糖苷酶为嗜热嗜酸β-葡萄糖苷酶,有较强的热稳定性,且产酶周期短。这预示着其在食品、饲料和纤维素乙醇生产方面有重要的潜在运用价值。

金露梅中一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取富集及活性研究

本研究采用AB-8大孔吸附树脂、半制备高效液相色谱对金露梅枝叶中槲皮素-7-O-β-D-葡糖苷酸提取分离,并通过13 C NMR鉴定其化学结构,最后采用以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物的酶抑制剂筛选模型检测其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性和类型。结果显示:槲皮素-7-O-β-D-葡糖苷酸分布在20%乙醇大孔吸附树脂(AB-8)洗脱液中,采用半制备高效液相色谱和高效液相色谱分离纯化得槲皮素-7-O-β-D-葡糖苷酸2481.8 mg,纯度为97.95%。活性检测结果表明,槲皮素-7-O-β-D-葡糖苷酸对α-葡萄糖苷酶的最大抑制率为94.67%,IC 50为0.259 mmol/L,抑制率显著高于阳性对照药物阿卡波糖,且抑制剂类型为竞争性抑制。

西瓜枯萎病菌致病力与镰刀菌酸和β-1,4葡萄糖苷酶活性的关系研究

镰刀菌酸是枯萎病菌产生的一种非寄主特异性致病毒素。β 葡萄糖苷酶在枯萎病病程中起着降解细胞壁纤维素破坏植物细胞组织的作用。为了探索西瓜枯萎病菌的镰刀菌酸产量和β 1,4 葡萄糖苷酶活性与致病力的关系 ,本试验测定了 2 8个采自新疆的菌株 ,发现其镰刀菌酸的产量极不稳定 ,且与致病力强弱无关 ,而 β 1。

通过体外分子进化技术获得耐高温β-葡萄糖苷酸酶的研究

采用高保真聚合酶从质粒pBI12 1中扩增出 1.8kb的专一条带 ,克隆入pBluescriptSK载体 ,测序结果显示与报道一致。该克隆GUS基因被用作对照 ,再以此为模板 ,通过DNA重排技术 ,经DNaseⅠ降解 ,PrimerlessPCR ,PrimerPCR重新得到大量的突变GUS基因。这些突变的GUS基因构建入原核表达载体pG2 5 1中 ,电击转化大肠杆菌菌株DH5α ,构建GUS基因突变体库 ,经过 3轮的重排、筛选得到 80℃处理 30分钟仍显示较高活性的耐高温GUS基因GUS3 3,基因测序显示 ,GUS3 3与GUS基因之间的同源性为 99.2 % ,核苷酸序列推导的氨基酸序列显示 ,11个氨基酸发生了突变 ,80 %的突变集中在蛋白的C端。Tm值GUS3 3为 80℃ ,GUS ck为 5 5℃ ,提高了 2 5℃ ,GUS3 3β -葡萄糖苷酸酶热稳定性有了很大的提高 ,GUS3 3酶的最适温度明显提高。

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

高产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌在葡萄汁酸面团面包中的应用

从4种酒曲中分离筛选乳酸菌,并通过七叶苷平板显色法结合酶活测定筛选出3株高产β-葡萄糖苷酶的菌株。通过16SrDNA基因鉴定其种属,研究了3株菌粗酶液的最适温度、pH,并对酶进行定位。应用高产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌发酵葡萄汁酸面团制作面包,通过固相微萃取气相色谱质谱联用技术(GC—MS)分析了面包香气成分,并进行了感官评定。结果表明:酒曲中一共筛得124株乳酸菌,其中产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌有28株,产酶能力最高的3株乳酸菌经鉴定为哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis,M12和M24)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus,J28)。用M12发酵葡萄汁酸面团制作面包(RSB),RSB中一共检测出52种风味物质,较普通酵母面包(CYB)的风味物质种类增加了52.9%,而风味物质总峰面积也提高了65.5%。经过感官评定,RSB的整体接受度优于普通酵母面包(CYB)及含未发酵葡萄汁的酵母面包(RYB)。

尼泊尔酸模α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗菌活性研究

目的:对尼泊尔酸模根和地上部分的不同溶剂提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用及抗菌活性进行研究。方法:采用索氏提取法提取尼泊尔酸模不同部位,以96微孔板法测定α-葡萄糖苷酶抑制作用,采用纸片扩散法测定其抑菌圈及MIC值。结果:尼泊尔酸模根和地上部分各提取物均有较好的α-葡萄糖苷酶抑制作用,各提取物的IC50值大小为:RNAE(2.13μg/mL)、RNAM(2.13μg/mL)、RNRE(3.83μg/mL)、RNRM(22.5μg/mL)、RNRP(36.01μg/mL)和RNAP(56.59μg/mL),远低于阳性对照Acarbose(1081.27μg/mL)。抑制动力学实验表明,尼泊尔酸模地上部分乙酸乙酯提取物的抑制类型为非竞争性抑制,其甲醇提取物为混合型抑制。尼泊尔酸模根石油醚和乙酸乙酯部分有抑菌活性,尼泊尔酸模根石油醚部分对SA、MRSA、ESBLs的MIC分别为0.25、0.25、0.125mg/disc;尼泊尔酸模根乙酸乙酯部分对SA、MRSA的MIC分别为0.25、0.25mg/disc。结论:尼泊尔酸模各提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果均很好,尼泊尔酸模根的抑菌活性较好。

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与耐酸胁迫能力的相关性分析

目的:β-葡萄糖苷酶是葡萄酒中结合态香气物质释放的关键酶,但其活性受诸多因素的影响。本研究旨在从酒酒球菌自身耐酸能力的视角去分析评估菌株糖苷酶活性,探索酸胁迫下不同耐酸表型酒酒球菌与其β-葡萄糖苷酶活性之间存在的相关性关系。方法:结合利用离子注入诱变与胁迫环境筛选的方式,获得耐酸(p H 3.0)、酸敏(p H 9.0)突变酒酒球菌菌株,对其β-葡萄糖苷酶的活力进行测定,并筛选3组酸胁迫下表型差异大的β-葡萄糖苷酶基因送样测序。结果:耐酸突变酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶酶活力是出发菌株的2~4倍,是相应酸敏突变株的2~7倍。测序结果显示,除菌株a3的β-葡萄糖苷酶基因在108位(G置换成C)和1 232(A置换成T)位处发生了突变外,其余菌株β-葡萄糖苷酶的基因均未发生改变。结论:酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与菌株酸胁迫能力显著相关(P<0.05)。耐酸胁迫能力越强的菌株,β-葡萄糖苷酶活性越高。

[BMIM]PF_6/缓冲液两相体系中固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.

母乳β-葡萄糖醛酸苷酶与母乳性黄疸的关系

目的探讨母乳β-葡萄糖醛酸苷酶(-βGD)活性在母乳性黄疸(BMJ)发病机制中的作用。方法对14例BMJ患儿停母乳,改配方乳喂养3 d,后继续哺煮沸后母乳(灭活乳)3 d。于哺配方奶前、哺配方奶3 d末、哺灭活乳3 d末,分别采集不同乳类和粪便,测定-βGD活性,同时测定血清胆红素浓度。结果1.母乳-βGD活性为(87.60±44.67)U/mL,配方乳为(2.99±2.67)U/mL,灭活乳为(2.76±2.03)U/mL;母乳-βGD活性与配方乳和灭活乳比较均有非常显著差异(P均<0.001);配方乳β-GD活性与灭活乳比较无显著差异(P>0.05)。2.于哺配方乳前、哺配方乳3 d末、哺灭活乳3 d末,测定粪便-βGD活性分别为(310.12±131.98)、(326.86±138.26)和(337.91±143.21)U/g,组间无显著差异(F=0.033 P>0.05)。3.继续哺灭活乳患儿血清胆红素浓度持续下降,无1例出现反弹。结论1.母乳-βGD不是肠道内-βGD的主要来源,可能与BMJ发生关系不大。2.母乳中的一些加热可灭活因子可能与BMJ发生有关。

产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶基因的克隆与原核表达

产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)β-葡萄糖醛酸苷酶可定向转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸。根据β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列的同源保守区设计简并引物,PCR扩增克隆得到β-葡萄糖醛酸苷酶编码基因pgus(GenBank登录号:EU095019),该基因全长1815bp,编码604个氨基酸,理论单亚基分子量为67.77×103,含有4个潜在的N-糖基化位点。构建原核表达载体pET-28a(+)-pgus,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达pgus基因的重组菌。经IPTG诱导表达、Ni2+-NTA亲和层析柱纯化的重组酶PGUS-E,纯度达到95%以上,得率为25.6mg·L-1,SDS-PAGE分析检测分子量约为70×103,比酶活达到6368U·mg-1。

高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶活性的相关性

目的探讨高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-GD)活性的关系。方法选取2018年1~12月入院治疗的高胆红素血症新生儿50例为高胆红素血症组,选取非高胆红素血症新生儿30例为对照组。通过16S rRNA高通量测序方法分析两组新生儿肠道菌群的差异。通过酚酞-葡萄糖醛酸底物法测定高胆红素血症新生儿治疗前后肠道内的β-GD活性。结果对治疗前高胆红素血症组和对照组肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有52种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。对治疗后第3天高胆红素血症组和对照组入组3 d后肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有42种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。高胆红素血症组新生儿治疗后,埃希氏菌属和葡萄球菌属在肠道内的含量明显低于治疗前(P<0.05),粪便中β-GD活性较治疗前明显降低(P<0.05)。高胆红素血症新生儿治疗前后粪便β-GD活性与葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度均呈正相关(rs=0.5948~0.7245,均P<0.01)。结论高胆红素血症新生儿和非高胆红素血症新生儿肠道菌群存在差异。高胆红素血症新生儿粪便中β-GD活性与差异菌葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度呈正相关。肠道菌群可能通过调节β-GD活性影响新生儿高胆红素血症的发生,通过对新生儿肠道菌群和β-GD活性进行测定和分析,可能对早期评估新生儿高胆红素血症的发生有一定的临床意义。

通过DNA改组技术获得高活性β-葡萄糖苷酸酶

β 葡萄糖苷酸酶是在植物转基因中广泛应用的报告基因 .以质粒pBI12 1中的GUS基因为基础 ,利用DNA改组方法 ,经DNaseⅠ降解 ,PrimerlessPCR ,PrimerPCR对GUS基因进行了突变和改组 ,然后将改组的GUS基因连接到原核表达载体pG2 5 1中 ,构建了库容为 10 8的突变体库 .经过活性的筛选 ,得到活性提高的克隆 ,再以此为基础 ,经过新的改组、筛选得到活性大幅度提高的克隆GUS2 4 .基因测序显示 ,GUS2 4与GUS基因之间的同源性为 99 7% ,共有 6个核苷酸位点发生了改变 ,分别是 :379位的A突变为G ,396位的T突变为C ,711位的G突变为A ,95 8位T突变为C ,990位的T突变为C ,1649位的A突变为G .核苷酸序列推导的氨基酸序列显示 ,3个氨基酸发生了突变 ,12 7位的Ser突变为Gly ,32 0位的Trp突变为Arg ,5 5 0位的Asn突变为Ser.X gluc染色检测和荧光测活结果显示GUS2 4基因表达的 β 葡萄糖苷酸酶基较GUS基因表达产物活性提高

海藻酸钠固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

本文研究了以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋方式固定β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化工艺。分别考察海藻酸钠浓度、戊二醛体积分数、氯化钙浓度、交联时间和固化时间对固定化酶相对酶活力的影响,并以正交试验确定β-葡萄糖醛酸苷酶最佳的固定化条件:海藻酸钠质量浓度35g/L、给酶量1600U/g载体、戊二醛体积分数0.2%、氯化钙质量浓度20g/L、交联时间2h、固化时间2h。研究表明此时固定化酶的回收率较高,可达到71.66%,本文使用的固定化工艺简单易行,具有广阔的工业前景。

没食子酸对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其降糖机制研究

目的研究没食子酸对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其抑制类型,探索酚酸类化合物在治疗糖尿病方面的价值及Caco-2细胞模型在筛选降糖药方面的作用。方法以麦芽糖为底物,采用酶-抑制剂模型和Caco-2细胞模型研究没食子酸对α-葡萄糖苷酶活力的影响,采用Caco-2细胞模型研究没食子酸对葡萄糖吸收的影响。结果没食子酸对两种模型的α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,半数抑制量(IC50)为577.5μg/mL和182.6μg/mL;250μg/mL的没食子酸对α-葡萄糖苷酶抑制作用低于同浓度的阿卡波糖(P<0.05)。没食子酸是α-葡萄糖苷酶的竞争型抑制剂。没食子酸对葡萄糖吸收有抑制作用。结论没食子酸对α-葡萄糖苷酶和葡萄糖吸收有一定抑制作用。Caco-2细胞模型在筛选降糖药方面具有重要意义。

糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性

以N-糖基化提高毕赤酵母重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)的热稳定性为目的,在PGUS-P模拟结构分析的基础上,半理性方法设计并通过定点突变引入具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列特征的新N-糖基化位点,经毕赤酵母重组表达后,获得了3个新糖基化的突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259。反应动力学分析表明,与原始PGUS-P相比,突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259催化甘草酸水解的Km变小,Kcat/Km增加,表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。热稳定性分析表明,PGUS-P-35和PGUS-P-259的热稳定性得到改善,在65℃下保温90 min,其热稳定性相对PGUS-P分别提高了13%和11%。研究表明在蛋白质的合适位点引入糖基修饰对提高蛋白的热稳定性具有促进作用。