不同干燥条件下黄芩主要成分含量及β-葡萄糖醛酸苷酶活性变化规律研究

[目的]揭示黄芩药材在不同干燥条件下主要成分及β-葡萄糖醛酸苷酶活性的变化规律,探究黄芩药材产地加工的适宜方法。[方法]制备不同干燥条件下的黄芩药材样品,研究干燥过程中黄芩药材样品的失水率、主要成分的含量及β-葡萄糖醛酸苷酶活性。[结果]不同干燥条件下黄芩药材中主要指标成分含量基本一致,黄芩苷含量均符合2020年版《中国药典》规定;随着干燥温度升高,药材中β-葡萄糖醛酸苷酶活性明显降低。[结论]不同干燥方式对黄芩主要成分含量影响较小,温度升高有效灭活黄芩药材中的β-葡萄糖醛酸苷酶,为黄芩产地加工提供了参考。

Aspergillus sp.DLCS-F18胞外嗜热嗜酸β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究

β-葡萄糖苷酶作为纤维素彻底降解为葡萄糖的关键酶,被广泛运用于饲料、食品和生物燃料等行业。然而,许多菌株分泌的胞外β-葡萄糖苷酶活性低且热稳定性差,限制了其在纤维素生物质降解中的应用。本研究使用稻草秸秆作为碳源诱导菌株Aspergillus sp.DLCS-F18分泌胞外β-葡萄糖苷酶。结果表明:其最适反应pH和温度分别为4.0和60℃,在55℃和60℃下,孵育120 min后仍能保持95%以上的相对活性。此外,其表现出对金属离子的耐受性,在10 mmol/L的Ni^(2+)、Co^(2+)、Pb^(2+)和Cu^(2+)存在时,仍保持75%以上的相对活性,发酵96 h达到最高活性(2.5±0.1)U/mL。以上结果表明Aspergillus sp.DLCS-F18胞外β-葡萄糖苷酶为嗜热嗜酸β-葡萄糖苷酶,有较强的热稳定性,且产酶周期短。这预示着其在食品、饲料和纤维素乙醇生产方面有重要的潜在运用价值。

高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶活性的相关性

目的探讨高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-GD)活性的关系。方法选取2018年1~12月入院治疗的高胆红素血症新生儿50例为高胆红素血症组,选取非高胆红素血症新生儿30例为对照组。通过16S rRNA高通量测序方法分析两组新生儿肠道菌群的差异。通过酚酞-葡萄糖醛酸底物法测定高胆红素血症新生儿治疗前后肠道内的β-GD活性。结果对治疗前高胆红素血症组和对照组肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有52种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。对治疗后第3天高胆红素血症组和对照组入组3 d后肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有42种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。高胆红素血症组新生儿治疗后,埃希氏菌属和葡萄球菌属在肠道内的含量明显低于治疗前(P<0.05),粪便中β-GD活性较治疗前明显降低(P<0.05)。高胆红素血症新生儿治疗前后粪便β-GD活性与葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度均呈正相关(rs=0.5948~0.7245,均P<0.01)。结论高胆红素血症新生儿和非高胆红素血症新生儿肠道菌群存在差异。高胆红素血症新生儿粪便中β-GD活性与差异菌葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度呈正相关。肠道菌群可能通过调节β-GD活性影响新生儿高胆红素血症的发生,通过对新生儿肠道菌群和β-GD活性进行测定和分析,可能对早期评估新生儿高胆红素血症的发生有一定的临床意义。

[BMIM]PF_6/缓冲液两相体系中固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.

通过体外分子进化技术获得耐高温β-葡萄糖苷酸酶的研究

采用高保真聚合酶从质粒pBI12 1中扩增出 1.8kb的专一条带 ,克隆入pBluescriptSK载体 ,测序结果显示与报道一致。该克隆GUS基因被用作对照 ,再以此为模板 ,通过DNA重排技术 ,经DNaseⅠ降解 ,PrimerlessPCR ,PrimerPCR重新得到大量的突变GUS基因。这些突变的GUS基因构建入原核表达载体pG2 5 1中 ,电击转化大肠杆菌菌株DH5α ,构建GUS基因突变体库 ,经过 3轮的重排、筛选得到 80℃处理 30分钟仍显示较高活性的耐高温GUS基因GUS3 3,基因测序显示 ,GUS3 3与GUS基因之间的同源性为 99.2 % ,核苷酸序列推导的氨基酸序列显示 ,11个氨基酸发生了突变 ,80 %的突变集中在蛋白的C端。Tm值GUS3 3为 80℃ ,GUS ck为 5 5℃ ,提高了 2 5℃ ,GUS3 3β -葡萄糖苷酸酶热稳定性有了很大的提高 ,GUS3 3酶的最适温度明显提高。

产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶基因的克隆与原核表达

产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)β-葡萄糖醛酸苷酶可定向转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸。根据β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列的同源保守区设计简并引物,PCR扩增克隆得到β-葡萄糖醛酸苷酶编码基因pgus(GenBank登录号:EU095019),该基因全长1815bp,编码604个氨基酸,理论单亚基分子量为67.77×103,含有4个潜在的N-糖基化位点。构建原核表达载体pET-28a(+)-pgus,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达pgus基因的重组菌。经IPTG诱导表达、Ni2+-NTA亲和层析柱纯化的重组酶PGUS-E,纯度达到95%以上,得率为25.6mg·L-1,SDS-PAGE分析检测分子量约为70×103,比酶活达到6368U·mg-1。

母乳β-葡萄糖醛酸苷酶与母乳性黄疸的关系

目的探讨母乳β-葡萄糖醛酸苷酶(-βGD)活性在母乳性黄疸(BMJ)发病机制中的作用。方法对14例BMJ患儿停母乳,改配方乳喂养3 d,后继续哺煮沸后母乳(灭活乳)3 d。于哺配方奶前、哺配方奶3 d末、哺灭活乳3 d末,分别采集不同乳类和粪便,测定-βGD活性,同时测定血清胆红素浓度。结果1.母乳-βGD活性为(87.60±44.67)U/mL,配方乳为(2.99±2.67)U/mL,灭活乳为(2.76±2.03)U/mL;母乳-βGD活性与配方乳和灭活乳比较均有非常显著差异(P均<0.001);配方乳β-GD活性与灭活乳比较无显著差异(P>0.05)。2.于哺配方乳前、哺配方乳3 d末、哺灭活乳3 d末,测定粪便-βGD活性分别为(310.12±131.98)、(326.86±138.26)和(337.91±143.21)U/g,组间无显著差异(F=0.033 P>0.05)。3.继续哺灭活乳患儿血清胆红素浓度持续下降,无1例出现反弹。结论1.母乳-βGD不是肠道内-βGD的主要来源,可能与BMJ发生关系不大。2.母乳中的一些加热可灭活因子可能与BMJ发生有关。

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

海藻酸钠固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

本文研究了以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋方式固定β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化工艺。分别考察海藻酸钠浓度、戊二醛体积分数、氯化钙浓度、交联时间和固化时间对固定化酶相对酶活力的影响,并以正交试验确定β-葡萄糖醛酸苷酶最佳的固定化条件:海藻酸钠质量浓度35g/L、给酶量1600U/g载体、戊二醛体积分数0.2%、氯化钙质量浓度20g/L、交联时间2h、固化时间2h。研究表明此时固定化酶的回收率较高,可达到71.66%,本文使用的固定化工艺简单易行,具有广阔的工业前景。

通过DNA改组技术获得高活性β-葡萄糖苷酸酶

β 葡萄糖苷酸酶是在植物转基因中广泛应用的报告基因 .以质粒pBI12 1中的GUS基因为基础 ,利用DNA改组方法 ,经DNaseⅠ降解 ,PrimerlessPCR ,PrimerPCR对GUS基因进行了突变和改组 ,然后将改组的GUS基因连接到原核表达载体pG2 5 1中 ,构建了库容为 10 8的突变体库 .经过活性的筛选 ,得到活性提高的克隆 ,再以此为基础 ,经过新的改组、筛选得到活性大幅度提高的克隆GUS2 4 .基因测序显示 ,GUS2 4与GUS基因之间的同源性为 99 7% ,共有 6个核苷酸位点发生了改变 ,分别是 :379位的A突变为G ,396位的T突变为C ,711位的G突变为A ,95 8位T突变为C ,990位的T突变为C ,1649位的A突变为G .核苷酸序列推导的氨基酸序列显示 ,3个氨基酸发生了突变 ,12 7位的Ser突变为Gly ,32 0位的Trp突变为Arg ,5 5 0位的Asn突变为Ser.X gluc染色检测和荧光测活结果显示GUS2 4基因表达的 β 葡萄糖苷酸酶基较GUS基因表达产物活性提高

糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性

以N-糖基化提高毕赤酵母重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)的热稳定性为目的,在PGUS-P模拟结构分析的基础上,半理性方法设计并通过定点突变引入具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列特征的新N-糖基化位点,经毕赤酵母重组表达后,获得了3个新糖基化的突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259。反应动力学分析表明,与原始PGUS-P相比,突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259催化甘草酸水解的Km变小,Kcat/Km增加,表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。热稳定性分析表明,PGUS-P-35和PGUS-P-259的热稳定性得到改善,在65℃下保温90 min,其热稳定性相对PGUS-P分别提高了13%和11%。研究表明在蛋白质的合适位点引入糖基修饰对提高蛋白的热稳定性具有促进作用。

基于膨润土的层柱黏土固定β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

以膨润土制备的层柱黏土为载体,考察给酶量、固定化pH、温度和时间对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶活性的影响,并对其操作稳定性进行研究。结果表明:给酶量为2 700 U/g,最适pH为3.6,固定化温度40℃,固定化60 m in条件下固定化酶催化活性较高;酶经固定化后其热稳定性及储存稳定性显著提高。

内毒素调节肝脏β-葡萄糖苷酸酶mRNA的表达

目的:研究内毒素对小鼠肝脏细胞β-葡萄糖苷酸酶(GUSB)mRNA表达及其血清活性的影响.方法:选择23只BALB/c小鼠分为2组,对照组5只,腹腔注射不含内毒素的生理盐水;其余小鼠为实验组,腹腔注射LPS,并于注射后的1/2、2、4、24 h采用酶促动力学方法检测内源性β-葡萄糖苷酸酶(β-GD)活性;取肝脏,采用半定量RT-PCR方法检测GUSB mRNA的表达.结果:小鼠腹腔注射内毒素1/2、2和4h后,血清β-GD活性(3.96±0.88,4.40±0.55,5.65±0.58)显著高于对照组(2.14±1.46,P<0.05),而LPS 24 h组与对照组无显著性差异;内毒素刺激BALB/c小鼠2 h和LPS 4 h,其肝脏细胞GUSB mRNA表达(1.10±0.23,1.81±0.04)显著高于对照组(0.57±0.36,P<0.05),LPS 1/2 h和LPS 24 h的GUSB mRNA表达与对照组相比无显著性差异.结论:BALB/c小鼠经过腹腔注射LPS后,其血清中β-GD的酶活性具有显著性增加.LPS还可以增加小鼠肝脏细胞GUSB mRNA的表达.LPS可能通过增加组织β-GD活性的途径,参与了胆色素结石的发病.

β-葡萄糖醛酸苷酶键选择性高效筛选体系的构建与应用

分子改造是提高β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)在生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)过程中的键选择性的有效方法,但高通量筛选方法的缺失是限制其发展的重要瓶颈。为解决该问题,在大肠杆菌中构建了组成型表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E),利用温度诱导表达噬菌体裂解酶SRRz实现原位裂解的一锅法(one-pot)甘草酸键选择性筛选体系(CELS);同时考察了启动子强度对PGUS-E外源表达的效果,优化了不同温度下裂解酶SRRz的表达对酶释放效率的影响。结果表明,CELS筛选体系成功实现了集培养、产酶、裂解和反应于一体化工艺,并将其应用于PGUS-E的非理性改造,获得了一系列键选择性显著提高的突变酶。研究证明,TIM桶状结构域中α螺旋结构的变化对甘草酸键选择性的改善有很大的影响。

甲壳素固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

以甲壳素为载体、戊二醛为交联剂,固定β-葡萄糖醛酸苷酶,对β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化条件进行了研究,并通过正交实验确定了酶固定的最佳条件:戊二醛浓度0.7%,交联时间4h,吸附时间为9h,反应温度40℃,此时酶活力回收率可达67.32%。

β-葡萄糖醛酸苷酶荧光底物试卤灵葡萄糖醛酸苷的高效制备

以猴肝微粒体(Cy LM)为酶源,采用生物制备法实现了荧光底物试卤灵(Resorufin)向试卤灵葡萄糖醛酸苷(Resorufinβ-D-glucuronide)的高效转化,同时借助新型色谱分离材料C18WAX及固相萃取技术实现了Resorufinβ-D-glucuronide的高效富集及选择性洗脱,最终获得纯度大于98%的目标产物.所得产物结构经LC-MS,1H NMR和13C NMR等手段进行了表征.在此基础上,以该葡萄糖醛酸产物为探针底物建立了β-葡萄糖醛酸苷酶活性检测及抑制剂高通量筛选的方法.

内毒素调节血细胞释放β-葡萄糖苷酸酶的实验研究

目的研究内毒素可否增加小鼠血清β-葡萄糖苷酸酶(β-GD)的活性,以及内毒素对正常人外周血单核细胞(PBMC)产生β-葡萄糖苷酸酶的影响。方法按每公斤体重5mg内毒素(实验组)和生理盐水(对照组)腹腔注射BALB/c小鼠,并于注射后的1/2、2、4和24h取血液抗凝离心,上清液冻存;以1μg/mL内毒素(实验组)和生理盐水(对照组)刺激体外培养的外周血单核细胞,并分别于培养的2、4、8、12和24h取上清液;采用酶促动力学方法于pH值4.5条件下检测上清液β-GD活性。结果与对照组BALB/c小鼠比较,腹腔注射内毒素1/2、2和4小时后,血清β-葡萄糖苷酸酶活性显著增高,依次为(2.14±1.46),(3.96±0.88),(4.40±0.55),(5.65±0.58)Fishman单位,t值分别为2.548、2.896和4.474,P<0.05。正常人PBMC在与LPS共培养的4、8、12和24h,实验组β-GD活性显著高于对照组,分别为(1633.3±65.0)和(1106.7±48.6),(1926.0±147.1)和(1067.7±133.1),(1743.3±66.8)和(1016.7±147.7),(1553.7±79.6)和(1193.3±90.2)Fishman单位/106PBMC,t值分别为14.5、9.6、10.0和6.7,P<0.05。结论BALB/c小鼠经过腹腔注射内毒素后,其血清中β-GD的酶活性具有显著性增加。内毒素还可以增加正常人PBMC释放β-GD,此途径可能是内毒素参与胆石症发病的又一个机制。

离子液体对重组β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性的影响

研究了重组β-葡萄糖醛酸苷酶分别在含疏水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([Bmim]PF6)和亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([Bmim]BF4)的体系中催化4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)生成对硝基苯酚(pNP)的反应,并以缓冲液单相反应体系作为对照,考察离子液体对酶催化反应特性的影响。结果显示:[Bmim]PF6/缓冲液两相体系中最适底物浓度为10.0mmol/L,较缓冲液单相体系提高了1倍,确定了该体系动力学与热力学参数Vmax为0.153mmol/(L·min),Km为0.773mmol/L,表观活化能Ea为35.386kJ/mol;而缓冲液单相反应体系中Vmax为0.094mmol/(L·min),Km为0.620mmol/L,Ea为48.199kJ/moL,说表明离子液体[Bmim]PF6降低了反应活化能并提高了反应速率。

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染的人肾癌细胞的生物学特性观察

目的 :建立高表达 β 葡萄糖醛酸苷酶 (以下简称 βG)基因的肾癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性。方法 :构建真核表达载体 pcDNA3.1 βG ,并利用阳离子脂质体介导将其转入人肾癌细胞株GRC 1中。用mRNA打点杂交和Westernblot,鉴定其转录与表达水平 ,并通过光镜、电镜及细胞增殖周期检测等方法 ,观察转染细胞的生物学特性。结果 :在mRNA与蛋白水平证实 ,转染细胞内有 βG基因的高表达。透射电镜观察 ,转染细胞中的溶酶体、内质网丰富 ,细胞微绒毛及突起增多 ,但转染前后肾癌细胞GRC 1的周期及生长情况无显著性差别。结论 :应用脂质体介导法 ,将βG基因导入人肾癌GRC 1细胞后 ,获得生物学特性稳定 βG基因高表达的肾癌细胞模型 。