高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶活性的相关性

目的探讨高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-GD)活性的关系。方法选取2018年1~12月入院治疗的高胆红素血症新生儿50例为高胆红素血症组,选取非高胆红素血症新生儿30例为对照组。通过16S rRNA高通量测序方法分析两组新生儿肠道菌群的差异。通过酚酞-葡萄糖醛酸底物法测定高胆红素血症新生儿治疗前后肠道内的β-GD活性。结果对治疗前高胆红素血症组和对照组肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有52种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。对治疗后第3天高胆红素血症组和对照组入组3 d后肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有42种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。高胆红素血症组新生儿治疗后,埃希氏菌属和葡萄球菌属在肠道内的含量明显低于治疗前(P<0.05),粪便中β-GD活性较治疗前明显降低(P<0.05)。高胆红素血症新生儿治疗前后粪便β-GD活性与葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度均呈正相关(rs=0.5948~0.7245,均P<0.01)。结论高胆红素血症新生儿和非高胆红素血症新生儿肠道菌群存在差异。高胆红素血症新生儿粪便中β-GD活性与差异菌葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度呈正相关。肠道菌群可能通过调节β-GD活性影响新生儿高胆红素血症的发生,通过对新生儿肠道菌群和β-GD活性进行测定和分析,可能对早期评估新生儿高胆红素血症的发生有一定的临床意义。

[BMIM]PF_6/缓冲液两相体系中固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶基因的克隆与原核表达

产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)β-葡萄糖醛酸苷酶可定向转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸。根据β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列的同源保守区设计简并引物,PCR扩增克隆得到β-葡萄糖醛酸苷酶编码基因pgus(GenBank登录号:EU095019),该基因全长1815bp,编码604个氨基酸,理论单亚基分子量为67.77×103,含有4个潜在的N-糖基化位点。构建原核表达载体pET-28a(+)-pgus,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达pgus基因的重组菌。经IPTG诱导表达、Ni2+-NTA亲和层析柱纯化的重组酶PGUS-E,纯度达到95%以上,得率为25.6mg·L-1,SDS-PAGE分析检测分子量约为70×103,比酶活达到6368U·mg-1。

母乳β-葡萄糖醛酸苷酶与母乳性黄疸的关系

目的探讨母乳β-葡萄糖醛酸苷酶(-βGD)活性在母乳性黄疸(BMJ)发病机制中的作用。方法对14例BMJ患儿停母乳,改配方乳喂养3 d,后继续哺煮沸后母乳(灭活乳)3 d。于哺配方奶前、哺配方奶3 d末、哺灭活乳3 d末,分别采集不同乳类和粪便,测定-βGD活性,同时测定血清胆红素浓度。结果1.母乳-βGD活性为(87.60±44.67)U/mL,配方乳为(2.99±2.67)U/mL,灭活乳为(2.76±2.03)U/mL;母乳-βGD活性与配方乳和灭活乳比较均有非常显著差异(P均<0.001);配方乳β-GD活性与灭活乳比较无显著差异(P>0.05)。2.于哺配方乳前、哺配方乳3 d末、哺灭活乳3 d末,测定粪便-βGD活性分别为(310.12±131.98)、(326.86±138.26)和(337.91±143.21)U/g,组间无显著差异(F=0.033 P>0.05)。3.继续哺灭活乳患儿血清胆红素浓度持续下降,无1例出现反弹。结论1.母乳-βGD不是肠道内-βGD的主要来源,可能与BMJ发生关系不大。2.母乳中的一些加热可灭活因子可能与BMJ发生有关。

海藻酸钠固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

本文研究了以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋方式固定β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化工艺。分别考察海藻酸钠浓度、戊二醛体积分数、氯化钙浓度、交联时间和固化时间对固定化酶相对酶活力的影响,并以正交试验确定β-葡萄糖醛酸苷酶最佳的固定化条件:海藻酸钠质量浓度35g/L、给酶量1600U/g载体、戊二醛体积分数0.2%、氯化钙质量浓度20g/L、交联时间2h、固化时间2h。研究表明此时固定化酶的回收率较高,可达到71.66%,本文使用的固定化工艺简单易行,具有广阔的工业前景。

糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性

以N-糖基化提高毕赤酵母重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)的热稳定性为目的,在PGUS-P模拟结构分析的基础上,半理性方法设计并通过定点突变引入具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列特征的新N-糖基化位点,经毕赤酵母重组表达后,获得了3个新糖基化的突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259。反应动力学分析表明,与原始PGUS-P相比,突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259催化甘草酸水解的Km变小,Kcat/Km增加,表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。热稳定性分析表明,PGUS-P-35和PGUS-P-259的热稳定性得到改善,在65℃下保温90 min,其热稳定性相对PGUS-P分别提高了13%和11%。研究表明在蛋白质的合适位点引入糖基修饰对提高蛋白的热稳定性具有促进作用。

基于膨润土的层柱黏土固定β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

以膨润土制备的层柱黏土为载体,考察给酶量、固定化pH、温度和时间对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶活性的影响,并对其操作稳定性进行研究。结果表明:给酶量为2 700 U/g,最适pH为3.6,固定化温度40℃,固定化60 m in条件下固定化酶催化活性较高;酶经固定化后其热稳定性及储存稳定性显著提高。

β-葡萄糖醛酸苷酶荧光底物试卤灵葡萄糖醛酸苷的高效制备

以猴肝微粒体(Cy LM)为酶源,采用生物制备法实现了荧光底物试卤灵(Resorufin)向试卤灵葡萄糖醛酸苷(Resorufinβ-D-glucuronide)的高效转化,同时借助新型色谱分离材料C18WAX及固相萃取技术实现了Resorufinβ-D-glucuronide的高效富集及选择性洗脱,最终获得纯度大于98%的目标产物.所得产物结构经LC-MS,1H NMR和13C NMR等手段进行了表征.在此基础上,以该葡萄糖醛酸产物为探针底物建立了β-葡萄糖醛酸苷酶活性检测及抑制剂高通量筛选的方法.

β-葡萄糖醛酸苷酶键选择性高效筛选体系的构建与应用

分子改造是提高β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)在生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)过程中的键选择性的有效方法,但高通量筛选方法的缺失是限制其发展的重要瓶颈。为解决该问题,在大肠杆菌中构建了组成型表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E),利用温度诱导表达噬菌体裂解酶SRRz实现原位裂解的一锅法(one-pot)甘草酸键选择性筛选体系(CELS);同时考察了启动子强度对PGUS-E外源表达的效果,优化了不同温度下裂解酶SRRz的表达对酶释放效率的影响。结果表明,CELS筛选体系成功实现了集培养、产酶、裂解和反应于一体化工艺,并将其应用于PGUS-E的非理性改造,获得了一系列键选择性显著提高的突变酶。研究证明,TIM桶状结构域中α螺旋结构的变化对甘草酸键选择性的改善有很大的影响。

甲壳素固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

以甲壳素为载体、戊二醛为交联剂,固定β-葡萄糖醛酸苷酶,对β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化条件进行了研究,并通过正交实验确定了酶固定的最佳条件:戊二醛浓度0.7%,交联时间4h,吸附时间为9h,反应温度40℃,此时酶活力回收率可达67.32%。

离子液体对重组β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性的影响

研究了重组β-葡萄糖醛酸苷酶分别在含疏水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([Bmim]PF6)和亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([Bmim]BF4)的体系中催化4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)生成对硝基苯酚(pNP)的反应,并以缓冲液单相反应体系作为对照,考察离子液体对酶催化反应特性的影响。结果显示:[Bmim]PF6/缓冲液两相体系中最适底物浓度为10.0mmol/L,较缓冲液单相体系提高了1倍,确定了该体系动力学与热力学参数Vmax为0.153mmol/(L·min),Km为0.773mmol/L,表观活化能Ea为35.386kJ/mol;而缓冲液单相反应体系中Vmax为0.094mmol/(L·min),Km为0.620mmol/L,Ea为48.199kJ/moL,说表明离子液体[Bmim]PF6降低了反应活化能并提高了反应速率。

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染的人肾癌细胞的生物学特性观察

目的 :建立高表达 β 葡萄糖醛酸苷酶 (以下简称 βG)基因的肾癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性。方法 :构建真核表达载体 pcDNA3.1 βG ,并利用阳离子脂质体介导将其转入人肾癌细胞株GRC 1中。用mRNA打点杂交和Westernblot,鉴定其转录与表达水平 ,并通过光镜、电镜及细胞增殖周期检测等方法 ,观察转染细胞的生物学特性。结果 :在mRNA与蛋白水平证实 ,转染细胞内有 βG基因的高表达。透射电镜观察 ,转染细胞中的溶酶体、内质网丰富 ,细胞微绒毛及突起增多 ,但转染前后肾癌细胞GRC 1的周期及生长情况无显著性差别。结论 :应用脂质体介导法 ,将βG基因导入人肾癌GRC 1细胞后 ,获得生物学特性稳定 βG基因高表达的肾癌细胞模型 。

唾液β-葡萄糖醛酸苷酶与慢性牙周炎相关性研究

目的检测慢性牙周炎患者唾液β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-G)水平,并与治疗后及健康人群对照,以期明确β-G与慢性牙周炎的关系,为牙周炎诊断及疗效监测提供有效参考。方法选择18名慢性牙周炎患者,采集牙周基础治疗前及治疗后全唾液并记录牙周临床指数;检测全唾液中β-G(比色法)水平,并分析与牙周临床参数之间的相关性。结果 (1)基础治疗后,牙周临床参数改善明显(P<0.05);(2)治疗前实验组唾液β-G活性水平(2.845±0.72,10-3U·m L-1)与健康对照组(2.24±0.31,10-3U·m L-1)差异有显著性(P<0.05),与平均牙周袋深度(r=0.485)、深袋数(r=0.540)、深袋构成比(r=0.598)之间明显相关(P<0.05);治疗后β-G酶活性水平(2.18±0.71,10-3U·m L-1)明显下调(P<0.05),与对照组差异无显著性(P>0.05)。结论唾液β-G活性水平能在一定程度上反映当前牙周炎状态及控制程度,该指标可为牙周炎诊断和疗效监测提供参考。

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染人卵巢癌细胞的生物学特性

目的 :将β 葡萄糖醛酸苷酶 (βG)基因转入卵巢癌细胞系 3AO ,建立高表达 βG的卵巢癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性 .方法 :构建真核表达的逆转录病毒载体pcDNA3.1 βG ,利用阳离子脂质体将其转入人卵巢癌细胞株 ,用mRNA打点杂交、WesternBloting鉴定其转录与表达水平 ,并通过检测细胞生长、增殖及形态学的变化观察转染细胞的生物学特性 .结果 :转染阳性细胞 ,在mRNA与蛋白水平证实转染细胞内有 βG基因高表达 ;但转染前后细胞生长情况及细胞周期分析无显著性差别 .结论 :用脂质体介导法将βG基因在体外转染人卵巢癌 3AO细胞 ,经鉴定获得了生物学特性稳定的

大肠癌组织中β-半乳糖苷结合蛋白-3与β-葡萄糖醛酸苷酶表达的意义

目的:通过观察β-半乳糖苷结合蛋白-3(Galectin-3)与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-G)在大肠癌组织中的表达,与大肠癌的生物学特征进行比较,以探讨其临床意义.方法:采用SP免疫组织化学方法检测98例临床新鲜标本,其中包括15例癌旁正常大肠黏膜组织及83例大肠癌组织中galectin-3和β-G的表达情况,并进行两种蛋白的表达相关性分析.结果:Galectin-3和β-G蛋白在浸润程度深、分化程度低及Dukes分期较晚的大肠癌组织中的表达高于浸润程度浅(0.15±0.03 vs 0.16±0.05,P=0.02)、分化程度高(0.15±0.012 vs 0.16±0.03,P=0.03)及Dukes分期较早(0.18±0.06 vs 0.17±0.05)的大肠癌组织(P<0.05);在大肠癌组织中,ga-lectin-3的表达和β-G的表达呈正相关(r=0.628,P<0.01).结论:Galectin-3和β-G的异常表达在大肠癌的发生、发展中起着重要作用,具有一定的诊断价值.

重组β-葡萄糖醛酸苷酶转化甘草酸的定向性改造

为提高重组β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性,通过易错PCR方法对其进行突变并构建突变体文库,利用薄层层析和高效液相色谱对突变文库进行筛选,获得了突变株PGUS(M51)-E,其底物特异性提高了41%。突变酶的酶学特性研究发现,该突变酶的最适pH值和温度较PGUS-E无显著变化,酶活力下降了16.86%,Tm值提高了5℃;序列分析结果表明:PGUS(M51)-E共发生5处突变,其中3处发生在糖基结合域。因此,利用定向进化策略能有效提高β-葡萄糖醛酸苷酶的底物识别特异性。

β-葡萄糖醛酸苷酶与牙周炎的相关性研究进展

内源性β-葡萄糖醛酸苷酶是溶酶体内的酸性水解酶,主要来源于多形核白细胞,是细胞外基质主要成分大分子蛋白聚糖降解的酶原之一,直接参与细胞外基质的降解过程。由于该酶与肿瘤的转移能力和炎症活动状态密切相关,故近年来其检测技术和研究意义备受关注。笔者下面主要就内源性β-葡萄糖醛酸苷酶的活性水平与牙周炎症之间的相关性及其相关性研究的实际意义作一综述。

β-葡萄糖醛酸苷酶在肿瘤诊治中的应用

β-葡萄糖醛酸苷酶系存在于哺乳动物溶酶体中的糖蛋白 ,具有水解酶作用 .目前其已成为泌尿系统肿瘤诊断治疗的一种重要手段 .