产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶基因的克隆与原核表达

产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)β-葡萄糖醛酸苷酶可定向转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸。根据β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列的同源保守区设计简并引物,PCR扩增克隆得到β-葡萄糖醛酸苷酶编码基因pgus(GenBank登录号:EU095019),该基因全长1815bp,编码604个氨基酸,理论单亚基分子量为67.77×103,含有4个潜在的N-糖基化位点。构建原核表达载体pET-28a(+)-pgus,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达pgus基因的重组菌。经IPTG诱导表达、Ni2+-NTA亲和层析柱纯化的重组酶PGUS-E,纯度达到95%以上,得率为25.6mg·L-1,SDS-PAGE分析检测分子量约为70×103,比酶活达到6368U·mg-1。

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染的人肾癌细胞的生物学特性观察

目的 :建立高表达 β 葡萄糖醛酸苷酶 (以下简称 βG)基因的肾癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性。方法 :构建真核表达载体 pcDNA3.1 βG ,并利用阳离子脂质体介导将其转入人肾癌细胞株GRC 1中。用mRNA打点杂交和Westernblot,鉴定其转录与表达水平 ,并通过光镜、电镜及细胞增殖周期检测等方法 ,观察转染细胞的生物学特性。结果 :在mRNA与蛋白水平证实 ,转染细胞内有 βG基因的高表达。透射电镜观察 ,转染细胞中的溶酶体、内质网丰富 ,细胞微绒毛及突起增多 ,但转染前后肾癌细胞GRC 1的周期及生长情况无显著性差别。结论 :应用脂质体介导法 ,将βG基因导入人肾癌GRC 1细胞后 ,获得生物学特性稳定 βG基因高表达的肾癌细胞模型 。

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染人卵巢癌细胞的生物学特性

目的 :将β 葡萄糖醛酸苷酶 (βG)基因转入卵巢癌细胞系 3AO ,建立高表达 βG的卵巢癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性 .方法 :构建真核表达的逆转录病毒载体pcDNA3.1 βG ,利用阳离子脂质体将其转入人卵巢癌细胞株 ,用mRNA打点杂交、WesternBloting鉴定其转录与表达水平 ,并通过检测细胞生长、增殖及形态学的变化观察转染细胞的生物学特性 .结果 :转染阳性细胞 ,在mRNA与蛋白水平证实转染细胞内有 βG基因高表达 ;但转染前后细胞生长情况及细胞周期分析无显著性差别 .结论 :用脂质体介导法将βG基因在体外转染人卵巢癌 3AO细胞 ,经鉴定获得了生物学特性稳定的

疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的基因组挖掘与表达

基因组挖掘是发现生物催化剂的高效工具,开发热稳定性β-葡萄糖苷酶具有重要的应用价值.该文采用基因组挖掘策略,从嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌的基因组中挖掘出7个注释为β-葡萄糖苷酶基因或β-葡萄糖苷酶预测蛋白基因,其中TLG-1、TLG-2、TLG-4、TLG-5、TLG-6属于GH3家族,TLG-3和TLG-7分别属于GH1家族和GH17家族,且TLG-7与GenBank数据库已有序列的同源性很低,只有48.43%.选择同源性低的、同源序列被研究少的TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7进行基因克隆和毕赤酵母异源表达,重组毕赤酵母经甲醇诱导表达后,用发酵液上清进行SDS-PAGE分析,结果表明TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7均成功分泌表达.对发酵液进行β-葡萄糖苷酶活力测定结果表明:TLG-2的活力最高,达到166.6 U·mL^(-1);其次是TLG-5的活力,其值为79.8 U·mL^(-1),TLG-6和TLG-7的活力较低,分别为9.9 U·mL^(-1)和9.5 U·mL^(-1).研究结果为疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的应用奠定了基础.

不同干燥条件下黄芩主要成分含量及β-葡萄糖醛酸苷酶活性变化规律研究

[目的]揭示黄芩药材在不同干燥条件下主要成分及β-葡萄糖醛酸苷酶活性的变化规律,探究黄芩药材产地加工的适宜方法。[方法]制备不同干燥条件下的黄芩药材样品,研究干燥过程中黄芩药材样品的失水率、主要成分的含量及β-葡萄糖醛酸苷酶活性。[结果]不同干燥条件下黄芩药材中主要指标成分含量基本一致,黄芩苷含量均符合2020年版《中国药典》规定;随着干燥温度升高,药材中β-葡萄糖醛酸苷酶活性明显降低。[结论]不同干燥方式对黄芩主要成分含量影响较小,温度升高有效灭活黄芩药材中的β-葡萄糖醛酸苷酶,为黄芩产地加工提供了参考。

β-葡萄糖醛酸苷酶基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达

目的 探讨 β 葡萄糖醛酸苷酶 (βG)基因对人膀胱癌T2 4细胞的转染及表达的可行性。方法 采用基因工程技术构建带 βG基因的真核表达载体 ,利用脂质体介导法在体外将 βG基因导入人膀胱癌T2 4细胞 ,利用mRNA打点杂交、原位杂交、免疫组织化学、Westernbloting方法检测βG基因的转录和表达情况。 结果 成功克隆出含人 βG基因全长的真核表达载体 pcDNA3 .1 βG ,以阳离子脂质体LipofectAMINE为载体将βG基因转染T2 4细胞后 ,经 40 0mg/L的G41 8筛选后可形成抗性克隆 ;βG基因打点杂交和原位杂交结果显示转基因细胞中有 βGmRNA的高表达 ;免疫组织化学和Westernbloting证实转基因细胞中有 βG蛋白的强阳性高表达。

沉默尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因OfUGT逆转亚洲玉米螟对Cry1Ie蛋白的抗性

转Bacillus thuringiensis(Bt)基因作物在害虫防治中应用较多,但长期种植转Bt基因作物,靶标害虫不可避免会对杀虫蛋白产生抗性,如何进行抗性治理是当前面临的难题。本研究基于前期转录组分析结果,定量分析了尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因(Of UGT)在亚洲玉米螟Cry1Ie抗性品系(ACB-IeR)及敏感品系(ACB-Bt S)的表达量,利用RNA干扰技术(RNAi)对ACB-IeR品系Of UGT基因进行沉默,并通过毒力测定试验来检验干扰效果。Of UGT基因在ACB-Ie R三龄幼虫中相对表达量高于ACB-Bt S,并且注射ds UGT后该基因表达量下降。Cry1Ie抗性品系的致死中浓度大于1000.00μg/g,在蛋白浓度为500.00μg/g时,注射ds UGT和ds GFP后的幼虫存活率没有显著性差异,但较空白对照组存活率显著降低;在蛋白浓度为1000.00μg/g时,注射ds GFP后的幼虫存活率较空白对照组降低,注射ds UGT后的幼虫存活率较空白对照和注射ds GFP的都显著降低。由结果可以看出RNAi沉默OfUGT基因后可以降低抗性品系亚洲玉米螟对Cry1Ie蛋白的抗性,但对抗性的逆转程度还需要后续更进一步的研究。

青果不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

目的:探究青果不同溶剂提取物的成分差异及对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。方法:使用水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇对青果进行提取,分别测定不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,明确其抑制类型,并检测不同提取液中没食子酸、鞣花酸、总黄酮含量。结果:各溶剂提取物均对α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用,其抑制类型为可逆性非竞争性抑制作用;70%乙醇提取物抑制效果最佳,半抑制浓度(IC50)为9.914×10^(3)µg/mL,没食子酸、鞣花酸、总黄酮含量分别为(5.33±0.03)mg/g、(12.61±0.12)mg/g、(19.05±0.02)mg/g。结论:青果提取液成分中没食子酸对提取溶剂不敏感,鞣花酸及总黄酮水溶性不佳;对α-葡萄糖苷酶的抑制效果总体以70%乙醇提取液最佳,酶抑制率最高,此为青果开发提供了依据。

没食子酸衍生物抑制α-葡萄糖苷酶的机理研究

为明确没食子酸及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的影响,采用紫外分光光度法、荧光光谱法和分子对接技术分别对没食子酸及其酯化衍生物与α-葡萄糖苷酶相互作用的情况进行了分析.结果表明:没食子酸(IC_(50)为9.80 mg·mL^(-1))、没食子酸甲酯(IC_(50)为6.16 mg·mL^(-1))、没食子酸乙酯(IC_(50)为2.97 mg·mL^(-1))和没食子酸丙酯(IC_(50)为1.00 mg·mL^(-1))均具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制能力;没食子酸及其衍生物均会静态猝灭α-葡萄糖苷酶的内源荧光,不同温度下结合常数K_(a)均超过10~5 L·mol^(-1),结合位点n≈1,相互作用的主要驱动力为氢键和疏水作用力,表明酯基的存在能强化没食子酸与α-葡萄糖苷酶的结合,但随着酯基的延长,分子间的空间位阻增加,相互作用的概率下降;没食子酸衍生物能够改变酶的构象,有效增强α-葡萄糖苷酶的色氨酸(Trp)残基和酪氨酸(Tyr)残基所在微环境的极性;没食子酸及其衍生物结合于α-葡萄糖苷酶的同一个疏水口袋内,主要与Ser 288,Ile 523和Lys 776通过氢键结合.综上所述,没食子酸及其衍生物可以结合α-葡萄糖苷酶的特定位点,通过改变微环境、酶构象等可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性,以期为筛选或改造高活性α-葡萄糖苷酶抑制剂提供理论基础.

腐乳酸浆水中产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的研究

桂林腐乳酸浆水是桂林腐乳制作过程中的凝固剂,其富含的微生物赋予了腐乳特有的品质。而桂林腐乳酸浆水中乳酸菌的种类及其具有的优良功能活性尚不清晰。该研究从酸浆水中筛选出10株乳酸菌,其中5株具有产β-葡萄糖苷酶能力。经生理生化和16S rRNA鉴定,a1、a3、a7和b16为利莫西发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum),b8为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)。b8展现出最高的β-葡萄糖苷酶活力(发酵6 h时为(41.22±0.47)U/105 CFU),生长活力和产酸能力也显著高于其余4株产酶乳酸菌(P<0.05)。此外,德氏乳杆菌b8在培养12 h时的DPPH、ABTS自由基清除率分别为(16.29±2.22)%、(51.02±2.43)%。综上,德氏乳杆菌b8具有较好的功能活性和生长活力,该研究既丰富了对桂林腐乳酸浆水中乳酸菌的认识,又为豆制品行业提供了潜在的功能性发酵菌株。

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶活性的相关性

目的探讨高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-GD)活性的关系。方法选取2018年1~12月入院治疗的高胆红素血症新生儿50例为高胆红素血症组,选取非高胆红素血症新生儿30例为对照组。通过16S rRNA高通量测序方法分析两组新生儿肠道菌群的差异。通过酚酞-葡萄糖醛酸底物法测定高胆红素血症新生儿治疗前后肠道内的β-GD活性。结果对治疗前高胆红素血症组和对照组肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有52种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。对治疗后第3天高胆红素血症组和对照组入组3 d后肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有42种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。高胆红素血症组新生儿治疗后,埃希氏菌属和葡萄球菌属在肠道内的含量明显低于治疗前(P<0.05),粪便中β-GD活性较治疗前明显降低(P<0.05)。高胆红素血症新生儿治疗前后粪便β-GD活性与葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度均呈正相关(rs=0.5948~0.7245,均P<0.01)。结论高胆红素血症新生儿和非高胆红素血症新生儿肠道菌群存在差异。高胆红素血症新生儿粪便中β-GD活性与差异菌葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度呈正相关。肠道菌群可能通过调节β-GD活性影响新生儿高胆红素血症的发生,通过对新生儿肠道菌群和β-GD活性进行测定和分析,可能对早期评估新生儿高胆红素血症的发生有一定的临床意义。

胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1基因突变与新生儿黄疸易感性的关系

目的探讨胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1基因(UGT1A1)第1外显子A1及启动子区TATA盒基因突变与广西新生儿黄疸的关系。方法 152例广西籍新生儿分为高胆红素血症组(病例组)102例及健康对照组50例,采用PCR和DNA直接测序法检测两组UGT1A1第1外显子及启动子区TATA盒基因型,比较两组UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因频率差异,观察病例组UGT1A1基因突变类型及其不同基因型患儿出生后72 h后血清总胆红素水平。结果两组UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因频率比较差异有统计学意义(P均<0.01)。病例组检出G71R错义突变40例,启动子A(TA)7突变2例,715C→T杂合无义突变1例。病例组G71R纯合子患儿血清总胆红素水平高于野生型及杂合子患儿(P均<0.05)。结论 UGT1A1基因G71R突变是广西新生儿黄疸主要突变类型,该突变与新生儿高胆红素血症有密切关系;新发现的715C→T无义突变可能是新生儿胆红素脑病发生的重要原因之一。

新生儿迁延性黄疸与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因突变的关系

目的探讨胆红素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT1A1)基因Gly71Arg变异与北京地区汉族新生儿黄疸发病的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性长度多态性方法测定无亲缘关系的北京地区汉族新生儿黄疸[病例组,n=96,总胆红素(307.6±38.5)μmoL/L,未结合胆红素(292.9±35.9)μmoL/L]与健康对照组[n=101,总胆红素(131.2±42.1)μmoL/L,未结合胆红素(126.3±39.7)μmoL/L]UGT1A1Gly71Arg基因多态性的基因型,并检验二组基因型分布、等位基因频率差异和UGT1A1基因Gly71Arg变异对病例组总胆红素的效应。采用SPSS10.0软件进行统计学分析,组间差异采用t检验及协方差分析,基因型频率采用χ2检验。结果病例组新生儿UGT1A1Gly71Arg基因多态性频率与健康对照组存在明显差异(χ2=9.47P<0.01),Arg等位基因频率明显高于健康对照组(χ2=10.34P<0.01)。病例组新生儿UGT1A1Gly71Arg基因多态性Arg等位基因纯合子携带者总胆红素水平明显高于杂合子携带者和非携带Arg等位基因者(Pa<0.001),采用协方差分析校正胎龄和出生体质量影响后,Arg等位基因纯合子携带者总胆红素水平仍明显高于杂合子携带者和非携带Arg等位基因者(Pa<0.001)。结论UGT1A1基因Gly71Arg变异可能是北京地区汉族新生儿黄疸的发病原因之一,该基因多态性Arg等位基因纯合子携带者黄疸更严重。

[BMIM]PF_6/缓冲液两相体系中固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.

母乳β-葡萄糖醛酸苷酶与母乳性黄疸的关系

目的探讨母乳β-葡萄糖醛酸苷酶(-βGD)活性在母乳性黄疸(BMJ)发病机制中的作用。方法对14例BMJ患儿停母乳,改配方乳喂养3 d,后继续哺煮沸后母乳(灭活乳)3 d。于哺配方奶前、哺配方奶3 d末、哺灭活乳3 d末,分别采集不同乳类和粪便,测定-βGD活性,同时测定血清胆红素浓度。结果1.母乳-βGD活性为(87.60±44.67)U/mL,配方乳为(2.99±2.67)U/mL,灭活乳为(2.76±2.03)U/mL;母乳-βGD活性与配方乳和灭活乳比较均有非常显著差异(P均<0.001);配方乳β-GD活性与灭活乳比较无显著差异(P>0.05)。2.于哺配方乳前、哺配方乳3 d末、哺灭活乳3 d末,测定粪便-βGD活性分别为(310.12±131.98)、(326.86±138.26)和(337.91±143.21)U/g,组间无显著差异(F=0.033 P>0.05)。3.继续哺灭活乳患儿血清胆红素浓度持续下降,无1例出现反弹。结论1.母乳-βGD不是肠道内-βGD的主要来源,可能与BMJ发生关系不大。2.母乳中的一些加热可灭活因子可能与BMJ发生有关。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因多态性的研究进展

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)是生物体内进行第Ⅱ相生物转化时最重要的一种酶。UGT广泛分布于人体的肝、肾和肠等不同组织,代谢大量的外源性毒性物质和内源性物质。研究发现,UGT1A基因多态性是个体间葡萄糖醛酸化活性差异的重要原因之一。本文就UGT1A基因多态性的研究现状予以综述。

海藻酸钠固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

本文研究了以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋方式固定β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化工艺。分别考察海藻酸钠浓度、戊二醛体积分数、氯化钙浓度、交联时间和固化时间对固定化酶相对酶活力的影响,并以正交试验确定β-葡萄糖醛酸苷酶最佳的固定化条件:海藻酸钠质量浓度35g/L、给酶量1600U/g载体、戊二醛体积分数0.2%、氯化钙质量浓度20g/L、交联时间2h、固化时间2h。研究表明此时固定化酶的回收率较高,可达到71.66%,本文使用的固定化工艺简单易行,具有广阔的工业前景。