肠癌患者肠道菌群中大肠埃希菌携带β-葡萄糖醛酸酶基因的鉴定与特征

目的探讨肠癌患者肠道菌群中大肠埃希菌携带β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase,GUS)基因序列变化特征,为肠癌的防治与诊断提供新的思路.方法采集肠癌患者晨起粪便,常规方法分离大肠埃希菌,提取细菌基因组DNA,设计GUS基因特异性引物,进行PCR扩增及测序分析.结果 10例肠癌患者肠道菌群中大肠埃希菌均携带GUS基因,与Gen Bank(Acession No.S69414.1)uid A基因序列同源性为99%,分别在第1141和1148位A缺失,第1149位A突变成T,第1158位A突变成G.结论肠癌患者大肠埃希菌GUS基因同时出现基因突变和缺失,可成为肠癌诊断的新标记物.

肠癌患者肠道菌群分析及携带β-葡萄糖醛酸酶基因特征

目的探讨肠道菌群紊乱及β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase,GUS)与结直肠恶性肿瘤的相关性.方法收集肠癌、肠癌前病变患者及其同期健康人员粪便样本,进行细菌培养并计数.水煮法提取大肠埃希菌DNA后行PCR扩增,采用分子克隆技术构建重组质粒,进行DNA测序比对.结果细菌培养结果显示:大肠埃希菌、酵母菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌在肠癌、肠癌前病变患者及健康对照3组间比较差异具有统计学意义(P<0.05).测序结果显示:肠癌前病变患者大肠埃希菌uidA基因序列第1497位置G突变成A.结论肠癌前病变患者肠道菌群失调在癌变早期已发生改变,大肠埃希菌uidA基因存在突变,肠癌的发生风险增加.

β-葡萄糖醛酸酶(GUS)在原发性肝内胆管结石形成中的作用

原发性肝内胆管结石(PIS)是我国西南地区高发和难治性疾病,对患者的生活造成极大的影响。胆道系统慢性感染产生的β-葡萄糖醛酸酶等代谢产物,在色素性结石的形成中起着重要作用,除细菌产生的外源性β-葡萄糖醛酸酶,肝内胆管细胞产生的内源性β-葡萄糖醛酸酶在结石的形成中亦扮演重要角色。本文就PIS发病机制中β-葡萄糖醛酸酶的作用研究进展予以分析,以期为PIS的防治提供可能的方式。

115462例新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查及基因突变分析

目的了解贵阳地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症发病情况和基因突变特点,为贵阳地区G6PD缺乏症的防治提供科学参考。方法募集该地区2020年8月至2023年1月出生的新生儿,应用荧光分析法对其血斑样本进行G6PD酶活性筛查,召回初筛阳性儿,完成G6PD酶活性诊断及多色探针荧光PCR熔解曲线法(Multicolor probe melting curve analysis method,MMCA)基因突变分析。结果共募集115462例新生儿,G6PD酶活性筛查血斑样本共筛出阳性1606例,筛查阳性率为1.39%(1606/115462),其中男性为1.83%(1130/61801)、女性0.89%(476/53661),男女新生儿G6PD酶活性初筛阳性率差异有统计学意义(P<0.01);召回初筛阳性患儿,G6PD基因突变检出率87.07%(909/1044),其中男性为90.09%(764/848),女性为73.98%(145/196),男女间G6PD基因突变检出率差异有统计学意义(P<0.01)。本研究共检出13种类型G6PD基因单一突变型(c.1024 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.1376 G>T、c.592C>T、c.871 G>A、c.519 C>T、c.392G>T、c.493 A>G、c.1004C>A、c.1360C>T、c.383T>C、c.517T>C)和6种复合突变型(c.1376 G>T杂合复合c.95A>G杂合突变、c.1024 G>T杂合复合c.95A>G杂合突变、c.1024 C>T杂合复合c.1388 G>A杂合突变、c.1024 C>T杂合复合c.519C>T杂合突变、c.1376 G>T杂合复合c.1024 C>T杂合突变、c.95A>G杂合复合c.1388 G>A杂合突变)。贵阳地区G6PD缺乏症基因突变类型复杂多样,G6PD突变常见类型为c.1024 C>T、c.1388G>A、c.95 A>G、c.1376G>T这四种类型。结论贵阳地区G6PD基因突变位点具有明显地域性特征,开展G6PD酶活性筛查及相关诊断检测,有利于本地区G6PD缺乏症的筛查、确诊、治疗和防控,有效提高出生人口素质。

产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶基因的克隆与原核表达

产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)β-葡萄糖醛酸苷酶可定向转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸。根据β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列的同源保守区设计简并引物,PCR扩增克隆得到β-葡萄糖醛酸苷酶编码基因pgus(GenBank登录号:EU095019),该基因全长1815bp,编码604个氨基酸,理论单亚基分子量为67.77×103,含有4个潜在的N-糖基化位点。构建原核表达载体pET-28a(+)-pgus,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达pgus基因的重组菌。经IPTG诱导表达、Ni2+-NTA亲和层析柱纯化的重组酶PGUS-E,纯度达到95%以上,得率为25.6mg·L-1,SDS-PAGE分析检测分子量约为70×103,比酶活达到6368U·mg-1。

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染的人肾癌细胞的生物学特性观察

目的 :建立高表达 β 葡萄糖醛酸苷酶 (以下简称 βG)基因的肾癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性。方法 :构建真核表达载体 pcDNA3.1 βG ,并利用阳离子脂质体介导将其转入人肾癌细胞株GRC 1中。用mRNA打点杂交和Westernblot,鉴定其转录与表达水平 ,并通过光镜、电镜及细胞增殖周期检测等方法 ,观察转染细胞的生物学特性。结果 :在mRNA与蛋白水平证实 ,转染细胞内有 βG基因的高表达。透射电镜观察 ,转染细胞中的溶酶体、内质网丰富 ,细胞微绒毛及突起增多 ,但转染前后肾癌细胞GRC 1的周期及生长情况无显著性差别。结论 :应用脂质体介导法 ,将βG基因导入人肾癌GRC 1细胞后 ,获得生物学特性稳定 βG基因高表达的肾癌细胞模型 。

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染人卵巢癌细胞的生物学特性

目的 :将β 葡萄糖醛酸苷酶 (βG)基因转入卵巢癌细胞系 3AO ,建立高表达 βG的卵巢癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性 .方法 :构建真核表达的逆转录病毒载体pcDNA3.1 βG ,利用阳离子脂质体将其转入人卵巢癌细胞株 ,用mRNA打点杂交、WesternBloting鉴定其转录与表达水平 ,并通过检测细胞生长、增殖及形态学的变化观察转染细胞的生物学特性 .结果 :转染阳性细胞 ,在mRNA与蛋白水平证实转染细胞内有 βG基因高表达 ;但转染前后细胞生长情况及细胞周期分析无显著性差别 .结论 :用脂质体介导法将βG基因在体外转染人卵巢癌 3AO细胞 ,经鉴定获得了生物学特性稳定的

肝癌细胞内逆转录病毒介导β-葡萄糖醛酸苷酶基因的表达

目的 建立高表达 β-葡萄糖醛酸苷酶 (β- Glu)的肝癌细胞株 .方法 采用脂质体介导法 ,将重组逆转录病毒表达载体 p DOR- βG转染肝癌细胞 ,G418筛选出阳性克隆 ,用免疫组化法、酶组织化学法、原位杂交法及酶活性测定等方法观察 β-Glu表达情况 .结果 共获得 4株转染阳性克隆 ,其中 F1,H4为 β- Glu高表达克隆 .免疫组化法发现转染细胞 β- Glu免疫阳性物质主要分布于胞质及胞核内 ,酶组织化学法观察转染细胞酶活性产物主要集中于胞质中 ,且转染细胞较非转染细胞呈色深 .原位杂交法观察阳性杂交信号于胞质及胞核 ,甚至核仁中 ,且在转染细胞中杂交信号增强 .结论 通过转入人β-Glu基因可以建立 β- Glu肝癌高表达模型 .该模型的建立 ,既可用于观察β- Glu前体药物的基因治疗效果 ,也能观察β-

疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的基因组挖掘与表达

基因组挖掘是发现生物催化剂的高效工具,开发热稳定性β-葡萄糖苷酶具有重要的应用价值.该文采用基因组挖掘策略,从嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌的基因组中挖掘出7个注释为β-葡萄糖苷酶基因或β-葡萄糖苷酶预测蛋白基因,其中TLG-1、TLG-2、TLG-4、TLG-5、TLG-6属于GH3家族,TLG-3和TLG-7分别属于GH1家族和GH17家族,且TLG-7与GenBank数据库已有序列的同源性很低,只有48.43%.选择同源性低的、同源序列被研究少的TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7进行基因克隆和毕赤酵母异源表达,重组毕赤酵母经甲醇诱导表达后,用发酵液上清进行SDS-PAGE分析,结果表明TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7均成功分泌表达.对发酵液进行β-葡萄糖苷酶活力测定结果表明:TLG-2的活力最高,达到166.6 U·mL^(-1);其次是TLG-5的活力,其值为79.8 U·mL^(-1),TLG-6和TLG-7的活力较低,分别为9.9 U·mL^(-1)和9.5 U·mL^(-1).研究结果为疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的应用奠定了基础.

黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶提取工艺、酶学性质、实际应用研究

目的研究黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶(sbslGUS)提取工艺、酶学性质、实际应用。方法在单因素试验基础上,以粒度、加水量、提取时间、提取次数为影响因素,酶活性为评价指标,正交试验优化提取工艺。分析底物(黄芩苷)浓度与酶解速度的关系,计算V_(max)、K_(m),考察pH值、温度、金属离子对酶活性的影响,评价pH稳定性、热稳定性。sbslGUS酶解黄芩苷以制备黄芩素,考察pH值、温度、反应时间、底物初始浓度、加酶量对转化率的影响。结果最优提取工艺为粒度40目,加水量10倍,提取时间15 min,提取次数3次。酶解符合酶促反应动力学,K_(m)为0.0063 mol/L,V_(max)为70.42μmol/h,在pH值6.0、温度45℃、金属离子100 mmol/L Cu2+下酶活性最强,sbslGUS在pH值4.0~7.0、温度4~30℃范围内稳定性良好。最优制备工艺为pH值6.0,温度45℃,反应时间12 h以上,底物初始浓度67.2 mmol/L,加酶量1 mL/0.269 mmol黄芩苷,转化率为97.83%。结论sbslGUS酶解效率高,条件温和,可为获取黄芩素提供简便的制备方法,并且拓展了黄芩茎叶应用途径。

巨峰葡萄半乳糖醛酸转移酶基因GAUT克隆及在摘心处理下的表达分析

半乳糖醛酸转移酶(GAUT)是果胶合成过程的关键酶,对植物茎和叶的细胞壁等组织器官生长发育具有重要调控作用。为探究摘心处理下GAUT在葡萄茎和叶中的表达,以巨峰葡萄(Vitis labrusca×Vitis vinifera Kyoho)为材料,进行VvGAUTs克隆,利用生物信息学方法预测分析基因结构与功能,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在巨峰葡萄摘心处理下的表达模式。结果表明,本研究克隆得到4个巨峰葡萄GAUTs,开放阅读框(ORF)长度分别为1056、1167、1038和1071 bp,分别编码351、388、345和356个氨基酸,与葡萄基因组相应基因序列同源性均达到98%以上,分别命名为VvGAUT1a、VvGAUT1b、VvGAUT3、VvGAUT4a。VvGAUT1a编码稳定蛋白,其余3个基因编码不稳定蛋白;VvGAUTs与纤维素、木质素和糖代谢等相关蛋白密切互作。VvGAUTs在不同摘心处理的巨峰葡萄茎、叶中表达模式差异显著,2叶摘心处理总体上抑制茎VvGAUTs基因表达,而VvGAUTs在叶中的表达呈现生长前期增强、生长后期受抑制的趋势。此外,在巨峰葡萄生长前期VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3在茎、叶的表达明显高于生长后期,而VvGAUT4a在巨峰葡萄茎生长后期表达增强,在叶中表达变化较平缓。综上,摘心调控巨峰葡萄VvGAUTs基因表达,可能在控制其茎、叶生长,平衡营养生长和生殖生长过程中发挥重要作用。本研究结果为探究摘心调控葡萄树体生长的分子机制提供了理论依据。

茶黄素-3,3’-双没食子酸酯对α-葡萄糖苷酶的抑制机制

利用酶抑制动力学、多光谱、分子对接分析了茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(theaflavin-3,3’-digallate,TFDG)对α-葡萄糖苷酶的抑制机制,结果表明抑制是可逆的,并呈现竞争型和非竞争型混合抑制;TFDG与α-葡萄糖苷酶形成复合物猝灭其固有荧光;热力学参数表明结合是自发吸热、熵增的,且疏水相互作用是主要驱动力;结合增强了酪氨酸残基附近的疏水性和色氨酸残基周围的极性,降低了α-螺旋、β-折叠和β-转折的含量。分子对接显示TFDG结合在酶活性位点附近,并与附近氨基酸残基Phe450、Trp406之间存在两种疏水相互作用,且与Asp203、Phe450、Gln603形成3个氢键。本研究揭示了TFDG抑制α-葡萄糖苷酶的分子机理,为治疗糖尿病提供一种可行的候选功能因子。

饲料脂肪对翘嘴红鲌生长、葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性与基因表达的影响

选用360尾翘嘴红鲌(Erythrocutler ilishaeformis Bleeker),体质量约40g。随机分成为2组,分别为高脂组(脂肪质量分数19.93%,碳水化合物质量分数14.45%)、低脂组(脂肪质量分数9.92%,碳水化合物质量分数12.38%),每组设3个重复,饲养8周。分别于摄食后0h、3h、6h、12h、24h测定血液指标、糖代谢酶葡萄糖激酶(Glucokinase,GK,E.C.2.7.1.1)以及葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase,E.C.3.1.3.9)活性及基因表达,并分析高脂肪与低脂肪水平日粮对翘嘴红鲌生长的影响。与低脂水平日粮相比,高脂水平日粮组血液甘油三酯水平和游离脂肪酸水平分别在摄食后3h、12h有增加现象,肝胰脏粗蛋白与脂肪含量有显著增加(P<0.05)。与低脂水平日粮相比,在摄食后3～12h高脂肪水平日粮组糖代谢酶GK的mRNA水平显著增加(P<0.05),但是日粮脂肪水平并不能显著影响GK活性(P>0.05)。在摄食后3～24h高脂肪水平日粮组糖代谢酶G6Pase的mRNA水平得到显著促进,并在摄食后24hG6Pase活性显著增加(P<0.05)。因此,摄食高脂肪水平日粮能增加肝胰脏粗蛋白与脂肪含量,造成翘嘴红鲌高血糖效应,诱导G6Pase酶活性及基因的表达,这可能是影响翘嘴红鲌碳水化合物利用的原因之一。

过表达果糖脱氢酶促进氧化葡萄糖酸杆菌高效合成5-酮果糖

5-酮果糖(5-KetoFructose,5-KF)具有与D-果糖相似的甜度和自然甜味,且不能被人体代谢而具有低热量的优点,是一种具有发展前景的非营养型天然甜味剂。为了获得5-酮果糖高产菌株,作者将来源于Gluconobacter japonicus的膜结合的果糖脱氢酶基因在Gluconobacter oxydans中过表达,通过对不同的宿主、表达载体和启动子的筛选,获得一株能够高效合成5-KF的工程菌QT-10。在3 L发酵罐中进行补料发酵优化,最终采用恒速连续流加果糖的方式,该工程菌可在82 h内消耗质量浓度为650 g/L的D-果糖,5-KF的产量高达608 g/L,产率为94.6%,时空产率为7.41 g/(L·h)。

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

茵陈蒿汤对β-葡萄糖醛酸酶UDPGT影响的实验研究

目的:建立中医阳黄证黄疸动物模型,同时探讨清热利湿、利胆退黄中药茵陈蒿汤对阳黄证黄疸动物模型肝细胞摄取、转化、排泄胆红素的影响,揭示其利胆退黄的机制。方法:在采用异硫氰酸-1-萘酯(ANIT)灌胃诱导大鼠肝损伤的基础上,结合中医高脂高糖饮食加湿热环境因素,建立中医阳黄证黄疸动物模型。观察大鼠β—葡萄糖醛酸酶含量、UDPGT活性、D-木糖吸收率的变化,并予中药复健方茵陈蒿汤治疗。探讨其对肝细胞摄取、转化、排泄胆红素的影响。结果:中医阳黄证黄疸动物模型符合黄疸证疾病特点;同时模型大鼠出现明显湿热证主证及湿热证客观指标变化。经中药复健方治疗后,黄疸证和湿热证主证及指标明显改善。结论:茵陈蒿汤有保肝利胆退黄的作用,其机理可能与降低肝细胞β-葡萄糖醛酸酶含量、诱导UDPGT活性、促进胆红素排泄,从而改善胆红素代谢有关。

ELISA测定血清β-葡萄糖醛酸酶及临床应用

β－葡萄糖醛酸酶（β－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，β－Ｇ）存在于人体的各种组织及体液中，当机体患有癌症或发生恶变时，该酶活性增高。我们应用ＥＬＩＳＡ法对血清β－Ｇ进行检测，判断其在良恶性疾病筛选和诊断中的价值。１材料与方法１．１样品选择肿瘤组１１１例...

[BMIM]PF_6/缓冲液两相体系中固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.

新生儿迁延性黄疸与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因突变的关系

目的探讨胆红素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT1A1)基因Gly71Arg变异与北京地区汉族新生儿黄疸发病的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性长度多态性方法测定无亲缘关系的北京地区汉族新生儿黄疸[病例组,n=96,总胆红素(307.6±38.5)μmoL/L,未结合胆红素(292.9±35.9)μmoL/L]与健康对照组[n=101,总胆红素(131.2±42.1)μmoL/L,未结合胆红素(126.3±39.7)μmoL/L]UGT1A1Gly71Arg基因多态性的基因型,并检验二组基因型分布、等位基因频率差异和UGT1A1基因Gly71Arg变异对病例组总胆红素的效应。采用SPSS10.0软件进行统计学分析,组间差异采用t检验及协方差分析,基因型频率采用χ2检验。结果病例组新生儿UGT1A1Gly71Arg基因多态性频率与健康对照组存在明显差异(χ2=9.47P<0.01),Arg等位基因频率明显高于健康对照组(χ2=10.34P<0.01)。病例组新生儿UGT1A1Gly71Arg基因多态性Arg等位基因纯合子携带者总胆红素水平明显高于杂合子携带者和非携带Arg等位基因者(Pa<0.001),采用协方差分析校正胎龄和出生体质量影响后,Arg等位基因纯合子携带者总胆红素水平仍明显高于杂合子携带者和非携带Arg等位基因者(Pa<0.001)。结论UGT1A1基因Gly71Arg变异可能是北京地区汉族新生儿黄疸的发病原因之一,该基因多态性Arg等位基因纯合子携带者黄疸更严重。