胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

通过PCR从大肠杆菌(E.coliK12)基因组DNA中扩增出胱硫醚β-裂解酶(Cystathionineβ-lyase,CBL)基因,构建了能高效表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)。重组菌在30℃、0.5 mmol.L-1IPTG存在条件下诱导9 h,可溶性CBL的表达量达18 mg.L-1,占到菌体可溶性总蛋白的23%。将重组菌超声破碎后上清液经His-Trap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBL,回收率为71%,纯度达到94%,纯化后的CBL单位酶活为134.6 U.mg-1。为防止CBL溶液冻融后发生聚沉,向纯化后的酶液中加入5%甘油,-20℃保存。重组酶的最适反应温度为35℃,酶活性稳定的温度范围为20～35℃。重组酶的最适反应pH值为8.0,4℃下在pH值8.0的缓冲溶液中保温10 h酶稳定性最高。重组酶的KmL-cystathionine值为3.78 mmol.L-1,VmaxL-cystathionine值为0.928 mmol.L-1.h-1。本研究建立了基于CBL催化反应产物丙酮酸与2,4-二硝基苯肼显色原理测定CBL酶活性的新方法。

具有高胱硫醚β-裂解酶活性的葡萄酒酵母工程菌株的构建

【目的】构建具有较高胱硫醚β-裂解酶活性的葡萄酒酵母工程菌株,用于提高葡萄酒的香气品质。【方法】利用质粒pAUR123将大肠杆菌tnaA基因在中国本土酿酒酵母菌株LFP525中进行表达,得到的转化子进行酶活测定,并通过模拟汁和干白的发酵,评价其酿酒特性和产生硫醇类物质的能力。【结果】成功获得酵母工程菌株TH1和TH2,其胱硫醚β-裂解酶活性与受体菌比提高了32.25%-59.44%。模拟葡萄汁发酵显示,工程菌株中硫醇类物质的产量显著提高,是受体菌的2.8-4.3倍。工程菌株的发酵时间比受体菌略长,残糖和挥发酸显著高于宿主菌,但其含量处于正常范围。在长相思干白发酵试验中,该工程菌株的主要酿酒特性与受体菌相差不大,且硫醇类物质的产量提高了1.22倍。【结论】通过基因改造可以提高酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶活性,应用改良菌株可进一步提高葡萄酒的香气品质。

酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶的异源表达及催化生成糠硫醇

为明晰糠硫醇生物转化机制,将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)G20的胱硫醚β-裂解酶(cystathionineβ-lyase,Str3p)在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现异源表达,并验证其催化性质。正交设计试验优化大肠杆菌基因工程菌蛋白表达的诱导条件,其最适诱导表达条件为诱导温度20℃、异丙基硫代半乳糖苷浓度0.5 mmol/L、诱导时间13 h。该条件下获得的菌体经超声破碎和镍柱亲和层析,纯化得到的可溶性Str3p分子质量约为52 kDa,其表达量达1.26 mg/mL,较优化前的表达量和酶活力分别提高41.7%和38.6%。实验发现Str3p能够催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物生成糠硫醇,且催化过程受pH值影响较大,在pH 8.0时糠硫醇产量达到47μmol/L。本研究确定Str3p在E.coli BL21中的异源表达及催化特性,为生物转化合成天然糠硫醇提供新的参考途径。

胱硫醚-β-合成酶和胱硫醚-β-裂解酶在颈动脉体中的分布

本研究探讨胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-β-裂解酶(CSE)在颈动脉体中的分布。应用组织化学技术检测CBS和CSE在颈动脉体中的表达分布并进一步用激光共聚焦对该酶在细胞中的分布进行定位研究。结果表明小鼠颈动脉体I型上皮细胞表达CBS和CSE免疫活性,主要分布在胞浆的近细胞膜部位。结论为颈动脉体中氧感受器细胞表达CBS和CSE,提示内源性H2S可能影响颈动脉体化学感受器功能。

双子叶植物及单子叶植物中胱硫醚β-裂解酶的进化分析比较

胱硫醚 β-裂解酶(Cystathionineβ-lyase, CBL)是植物中蛋氨酸生物合成途径中的第二种酶,对常见植物 CBL 做进化分析并揭示其在植物生长发育中的重要作用。方法:本文选取 NCBI 数据库中常见的双子叶植物和单子叶植物已证实或预测的基因序列各十种,通过序列比对和构建系统发生树分析比较植物 CBL 的进化趋势和亲缘关系。结果:亲缘关系较近的植物 CBL 功能有一定相似,且单子叶植物与双子叶植物 CBL 进化差异明显。结论:植物 CBL 的进化分析比较为今后对其继续开展生物工程改良植物品质、开发新型抗生素或除草剂等研究提供可行的研究方向和理论基础。

中药海尔福、元首复方制剂对麦芽酚铝染毒小鼠β-淀粉样蛋白裂解酶1活性影响的实验研究

探讨中药复方海尔福、元首制剂对麦芽酚铝染毒小鼠β-淀粉样蛋白裂解酶1活性的影响。方法:选择50只SPF级KM品种小鼠为实验小鼠。前期试验阶段,实验小鼠随机分为十组,每组5只,除空白对照编号1、编号2组外,其余八组小鼠用30mmol/L浓度的麦芽酚铝溶液进行腹腔注射,每次按48mg/kg·d腹腔注射(30g体重小鼠每只0.2mL),每连续注射3天休息1天。建立模型30天后,进入后期实验,将小鼠分为正常组、模型组、治疗1组、治疗2组。治疗1组用中药复方海尔福制剂灌胃治疗,治疗2组用中药复元首制剂灌胃治疗,每天一次,连续30天。实验前期,所有组的小鼠进行水迷宫实验训练,确保全部小鼠熟练上岸,建立记忆。实验中、后期不再训练,直接进行连续3天水迷宫测定,每天三次,直至实验结束。记录所有小鼠游水时间和错误次数,以此来测定模型建立前、模型建立后和治疗后水迷宫游水时间和错误次数,作为小鼠记忆力变化的判断。实验结束,处死动物,体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)的活性。结果:依正常组、模型组、治疗1组、治疗2组顺序,脑β-淀粉样蛋白裂解酶1(BACE1)活力分别为(30.14±3.00)、(32.86±3.75)、(27.00±4.10)▲▲、(28.38±4.16)▲。方差分析:F=2.872,P=0.052,与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,差异有统计学意义。结论:中药复方海尔福、元首制剂对麦芽酚铝染毒小鼠β-淀粉样蛋白裂解酶1活性存在影响,治疗后明显降低。

胰岛素样生长因子-1对β-淀粉样前体蛋白裂解酶1的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme1,BACE1)的影响以及可能的细胞信号机制。方法:用不同剂量IGF-1(20、40 ng/ml和80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 24 h,荧光定量PCR及Western blot检测BACE-1mRNA及蛋白水平;Western blot检测淀粉样前体蛋白、C99、C83及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide3-kinase/serine threonine kinase,PI3-K/Akt)通路相关蛋白的水平;ELISA检测细胞培养液中β-淀粉样蛋白42(β-amyloid peptide,Aβ42)的水平,然后选择最佳剂量的IGF-1(80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,在此之前30 min加入PI3-K抑制剂LY294002(25μmol/L及50μmol/L),重复上述检测。结果:IGF-1降低BACE-1、C99及Aβ42的水平(P=0.000),提高C83的表达(P=0.000),增加Akt的磷酸化(P=0.000),而LY294002具有抑制IGF-1的上述作用。结论:IGF-1降低BACE-1mRNA及蛋白的水平,其机制可能涉及PI3-K/Akt信号通路。

海马高级糖基化终末产物受体和β-淀粉样前体蛋白裂解酶表达增加与自发性高血压大鼠认知功能损害相关性研究

目的:研究海马区域RAGE蛋白与BACE蛋白异常表达与自发性高血压大鼠(SHR)认知功能损害之间的关系。方法:采用SHR大鼠与正常血压大鼠(NWR)进行相关研究,增强型磁共振成像(MEMRI)检测大鼠海马脑区生理活动。采用Morris水迷宫、新事物识别实验分析大鼠的认知功能。使用Western blot分析海马区域高级糖基化终末产物受体(RAGE)与β-淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)蛋白的表达水平。使用免疫蛋白反应对NWR以及SHR大鼠脑切片进行Aβ斑块染色。结果:SHR相比NWR组,大鼠海马脑活动明显减少(0.698与1.499,P<0.01);Morris水迷宫中,SHR组大鼠在测试阶段对平台的寻找时间显著延长(35.3与12.2,P<0.01);新事物识别实验中,SHR组大鼠对新物体的探索时间显著降低(13.7与31.5,P<0.01);通过检测NWR与SHR组中大鼠海马区域RAGE与BACE蛋白的表达水平,发现RAGE与BACE的表达均有显著升高(0.407与0.789,P<0.05;0.733与1.502,P<0.01);对两组大鼠进行切片染色,发现SHR大鼠海马区域有大量Aβ阳性的斑块沉积。结论:SHR大鼠海马功能低下导致认知功能受损,与海马区域RAGE、BACE蛋白表达增加、Aβ斑块沉积有关。

上调miR-340减轻异丙酚反复麻醉诱导大鼠的学习记忆障碍

目的揭示miR-340-5p在异丙酚(Prop)反复麻醉诱导的大鼠学习记忆障碍中的调控作用。方法通过对大鼠连续5 d尾静脉输注异丙酚诱导学习记忆障碍动物模型,然后将大鼠随机分为4组:对照组、模型组、NC-agomir组和miR-agomir组,每组10只。建模时,对照组大鼠尾静脉输注脂肪乳,其他3组大鼠均尾静脉输注异丙酚。给药处理时,对照组和模型组大鼠侧脑室注射10μl的PBS缓冲液,NC-agomir组和miR-agomir组大鼠分别注射10μl的NC-agomir和miR-340-5p-agomir。给药48 h后,通过Morris水迷宫实验评价大鼠的学习记忆功能,并对海马组织进行尼氏染色。根据试剂盒说明书检测海马组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。通过qRT-PCR检测海马组织中miR-340-5p以及β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)、淀粉样前体蛋白695(APP695)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA水平。通过Western blot检测海马组织中BACE1、Bcl-2、Bax和β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)的蛋白表达水平。结果与模型组和NC-agomir组比较,miR-agomir组大鼠的逃避潜伏期缩短,而穿越平台次数增加(P<0.05)。与模型组和NC-agomir组比较,miR-agomir组大鼠尼氏体形态和数量均明显改善,海马组织中Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax降低(P<0.05)。与模型组和NC-agomir组比较,miR-agomir组大鼠海马组织中MDA水平降低,SOD水平升高(P<0.05);IL-6和TNF-α的mRNA水平降低(P<0.05),miR-340-5p水平升高,BACE1和APP695的mRNA表达水平以及BACE1和Aβ1-42的蛋白水平均降低(P<0.05)。结论上调miR-340-5p有效改善了异丙酚反复麻醉诱导的学习记忆障碍大鼠的学习记忆功能,miR-340-5p可能通过靶向抑制BACE1调节学习记忆功能。

外源性H_2 S通过调节β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达对PC12细胞APP/Aβ代谢的影响

目的观察外源性硫化氢对嗜铬细胞瘤细胞β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)的调节作用,进而探讨其对淀粉样前体蛋白/β-位淀粉样蛋白代谢途径的影响。方法用硫氢化钠作外源性H_2S供体,实验设空白对照组、NaHS 50 μmol/L组、NaHS 100μmol/L组和NaHS 200 μmol/L组,按分组浓度处理PC12细胞24 h后,RT-PCR和Western blot法检测细胞内BACE1 mRNA及蛋白表达,并用Western blot法继而检测APP代谢过程中关键蛋白APP、C99、C83表达变化,ELISA法检测细胞培养液中Aβ40和Aβ42水平。结果 NaHS在实验浓度范围内从基因与蛋白两个水平上呈剂量依赖性下调BACE1表达,并下调C99、Aβ40和Aβ42蛋白表达,上调C83蛋白,各NaHS组分别与对照组比较,差别均有统计学意义(P<0.05),而对APP蛋白表达没有影响,各组间比较差别无显著性(P>0.05)。结论外源性H_2S具有通过调节PC12细胞BACE1表达下调APP/Aβ代谢的作用。

蒜氨酸通过CBS/CSE途径改善小鼠非酒精性脂肪肝病的研究

【目的】研究蒜氨酸对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)小鼠肝脏中胱硫醚-β-裂解酶(cystathionine-β-synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)表达的影响,阐释蒜氨酸改善NAFLD的作用途径,为临床药物研发提供科学依据。【方法】50只雄性C57/6J小鼠随机分为5组:正常组、模型组、硫氢化钠组、蒜氨酸组和蒜氨酸+PAG组(DL-炔丙基甘氨酸,DL-propargylglycine,PAG),每组10只。正常组饲喂普通饲料,其他4组饲喂高脂饲料。蒜氨酸组灌胃给予蒜氨酸20 mg/kg;蒜氨酸+PAG组灌胃给予蒜氨酸20 mg/kg,同时腹腔注射PAG 15 mg/kg;硫氢化钠组腹腔注射硫氢化钠2 mg/kg;正常组和模型组灌胃给予等剂量的蒸馏水,每天1次,每周称体重1次,预防给药6周后处死,观察肝脏形态学和病理学变化,检测血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL-C)的水平,Western blotting检测肝脏组织中CBS和CSE蛋白表达水平。【结果】与正常组相比,模型组小鼠体重显著增加(P<0.05),其他组小鼠体重无显著变化(P>0.05)。形态学观察显示,模型组小鼠肝脏偏黄无光泽,成花斑状,其他组小鼠肝脏表面光滑、质地均匀、颜色与正常组小鼠接近。肝脏病理学HE染色可见,正常组切片正常,模型组出现明显脂肪空泡和脂滴沉积,说明脂肪肝模型建立成功;与模型组相比,硫氢化钠组和蒜氨酸组均有明显好转;与蒜氨酸组相比,蒜氨酸+PAG组抗脂肪变性作用减弱。与正常组相比,模型组小鼠血清中TG、TC、LDL-C均显著升高(P<0.05),各给药组小鼠TC、TG、LDL-C相较于模型组显著降低(P<0.05)。与正常组相比,模型组小鼠CBS和CSE蛋白表达水平显著下降(P<0.05),硫氢化钠组和蒜氨酸组干预后CBS和CSE蛋白表达水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);与模型组相相比,蒜氨酸+PAG组小鼠CBS和CSE表达无显著差异(P>0.05)。【结论】蒜氨酸可明显增加高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏组织中CBS和CSE表达,改善血清中血脂各项指标,减少小鼠肝细胞脂质沉积,发挥保护肝脏作用。

低氧对SH-SY5Y细胞miR-124及BACE1蛋白表达的影响

目的研究低氧对培养细胞miR-124及β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)蛋白表达的影响。方法培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),分为对照组、氧-糖剥夺组、Aβ1-42处理组、过表达或抑制miR-124组,用实时定量PCR方法检测miR-124表达,Western blot法检测BACE1蛋白表达。结果氧-糖剥夺处理48 h,细胞内miR-124表达水平明显下降,仅为对照组的46.9%(P<0.05),BAE1蛋白表达水平与较对照组增高36%(P<0.01);转染miR-124过表达组组细胞内miR-124表达水平较对照组增高245倍(P<0.01),为miR-124过表达对照组的219倍(P<0.01),BACE1蛋白表达水平较对照组下降了29%(P<0.05),较miR-124过表达对照组下降25%(P<0.05)。转染miR-124抑制剂组miR-124表达水平下降至对照组的45.4%(P<0.05),至miR-124抑制对照组的48%(P<0.05),BACE1表达水平较对照组升高21%(P<0.05),较miR-124抑制对照组升高40.3%(P<0.01);细胞经Aβ1-42处理24 h,miR-124表达水平较对照组下降52%(P<0.05),BACE1蛋白表达水平较对照组增高51%(P<0.05)。结论低氧通过降低SH-SY5Y细胞miR-124表达进而升高BAEC1蛋白表达,且可能在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)早期发病中发挥作用。

胰岛素信号通路PI3K/Akt对海马神经元β-淀粉样前体蛋白裂解酶1 mRNA水平的影响

目的通过胰岛素和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂渥曼青霉素(wortmarmm)对PI3K/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的激活和抑制作用,观察PI3K/Akt信号通路对海马神经元β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)mRNA水平表达的影响。方法 20只SD大鼠随机分为空白对照组、假手术组、胰岛素组和渥曼青霉素组,海马立体定向注射胰岛素和PI3K抑制剂渥曼青霉素。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PI3K/Akt信号传导下游蛋白Akt以及BACE1 mRNA水平。结果注射胰岛素的海马PI3K信号通路下游信号分子:Akt mRNA表达上调(分别较空白和阴性对照组p=0.047,p=0.002),而BACE1 mRNA表达下调(分别较空白和阴性对照组p=0.004,p=0.01)。渥曼青霉素组的PI3K下游信号分子Akt mRNA表达明显被抑制(分别较空白和阴性对照组p=0.002,p=0.039),同时BACE1 mRNA的表达较对照组上调(分别较空白和阴性对照组p=0.039,p=0.018)。结论胰岛素信号通路PI3K/Akt可以调节BACE1的转录水平参与阿尔茨海默病的发病机制。

何首乌及海尔福制剂对铝染毒小鼠脑组织β分泌酶及其他相关酶的影响研究

探讨中药对铝染毒小鼠脑组织 β 分泌酶及其他相关酶的影响。 方法:用铝水溶液拌饲料喂养小白鼠 90 天,然后分成三组,治 1 组,治 2 组,不治疗组即模型组,另设 1 组喂正常饲料的正常组。 治 1 组、 治 2 组 90 天后分别灌二种不同的中药 15 天,结束实验,取血,取脑作 10% 脑匀浆测定。 测定实验前、后的血红蛋白、水迷宫游水时间。 结果:治 1 组、治 2 组、模型组、正常组依次排列,脑乙酰胆碱酯酶(AchE)活力分别是 2.49±0.67▲▲、2.29±0.52▲、1.60±0.38、2.35±0.57▲( U / mg.prot),▲P<0.05,▲▲P<0.01,差异有统计学意义;脑乙酰胆碱转移酶(chAT)活力分别是 116.91±27.08、118.55±29.26、109.64±24.88、116.73±24.66( U / g 组织湿重),差异无统计学意义;β-位淀粉样前体蛋白裂解酶 1(BACE1)活力分别是 45.42±2.29、42.00±3.12★、40.17±2.51★★、39.82±2.42★★( U / L),与治 1 组比较,★P<0.05,★★P<0.01,差异有统计学意义;水迷宫时间,组间比较无显著性差异,组内前后比较,造模后治疗后时间均显著性延长;错误率、失败率增加,以模型组失败率增加最明显;造模前、治疗后血红蛋白(Hb)比较组间、前后均无明显变化。 结论:实验表明,铝染毒对(BACE1)活力影响不明显,但对乙酰胆碱酯酶(AchE)活力影响明显。 治 1 组(BACE1)活力明显升高,有待进一步研究。

miR-4792通过结合BACE1调节胰腺癌增殖、迁移和侵袭

目的探究miR-4792对胰腺癌增殖、迁移和侵袭的影响。方法下载GSE59856和GSE71533数据集,取上调表达的交集基因miR-4792,构建稳定过表达miR-4792的胰腺癌细胞系PANC-1、SW1990,采用CCK-8实验和Transwell小室实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力,通过裸鼠皮下种植瘤模型检测过表达miR-4792对肿瘤体内生长的影响,经Targetscan预测miR-4792的靶基因,下载GSE62452、TCGA数据集,筛选出基因β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(beta-site APP cleaving enzyme-1,BACE1),分析其表达与胰腺癌恶性临床表型的关系,并验证miR-4792与BACE1的靶向关系。结果与miR-NC组比较,miR-4792组miR4792水平升高,细胞增殖能力、迁移及侵袭细胞数均增加,肿瘤体积变化趋势明显增强,肿瘤组织体积、重量及miR-4792水平升高(P<0.05)。Targetscan预测miR-4792的靶基因为BACE1,其表达与胰腺癌复发、增殖、无进展生存期、预后、M分期及G分期密切相关(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证明,miR-4792可直接作用于靶基因BACE13′UTR下调其表达,与miR-NC组比较,miR-4792组BACE1 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。与miR-4792组比较,miR-4792+BACE1组BACE1蛋白表达增加,细胞增殖能力、迁移及侵袭细胞数均降低(P<0.05);但miR-4792+BACE1组和miR-NC组上述指标的比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-4792在胰腺癌中表达上调,其过表达可促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,可能与靶向下调BACE1有关。

人胱硫醚β-合酶及其截短型片段的表达、纯化和活性测定

将人胱硫醚β-合酶(CBS)基因克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得的重组质粒pGEX-4T-1-CBS转入大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)菌株,构建了高效表达CBS的重组菌E.coli Rosetta(pGEX4T-1-CBS)。重组菌在0.1mmol/L的IPTG于30℃诱导16h,可溶性CBS表达量达到28mg/L培养基。将重组菌破碎后上清液经GSTrap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBS融合蛋白,在凝血酶柱上切割缓冲液中加入3%甘油和0.1%CHAPS可以有效抑制酶切后CBS聚沉,酶活性回收率为54.8%,蛋白质产率为15.2mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为143U/mg,终浓度为1mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)可使CBS单位酶活提高5.1倍,达到735U/mg。同时构建了表达CBS1-413(删除了CBS羧基端调控域138个氨基酸残基)的重组菌E.coli Rosetta(pETDuet-1-CBS1-413),经过一步HisTrap Fast Flow亲和层析,酶活性回收率为74.3%,蛋白质产率为12.8mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为965U/mg;还表达和纯化了胱硫醚β-裂解酶(CBL),并在此基础上建立了一种新的CBL偶联的CBS酶活性测定方法。

跑台运动通过激活AMPK减少APP/PS1小鼠海马Aβ沉积

目的:探讨AMPK介导的运动减少APP/PS1小鼠海马Aβ沉积的分子机制。方法:将3月龄C57BL/6品系的APP/PS1小鼠和野生小鼠各48只分别随机分为APP/PS1安静对照组(ADC,n=24)、APP/PS1运动组(ADE,n=24)、野生安静对照组(WTC,n=24)和野生运动组(WTE,n=24)。ADE、WTE组进行12周跑台运动,同时ADC、WTC组置于安静跑台环境。采用ELISA实验测海马ATP、AMP含量,RT-qPCR实验测海马AMPK和BACE1mRNA水平,Western Blot实验测海马AMPK及其磷酸化(p-AMPK)蛋白表达、Sirt1、PPARγ、PGC1α、BACE1、Aβ等蛋白表达,免疫组化实验测海马SPs水平。结果:1) 12周跑台运动可提高APP/PS1小鼠海马, ATP、AMP含量,增加AMP/ATP比值(P<0.05);2)上调AMPK mRNA,上调AMPK蛋白表达及p-AMPK水平,上调Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表达水平(P<0.05);3)下调BACE1 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),同时下调Aβ蛋白和SPs(P<0.01)。结论:12周跑台运动减少APP/PS1小鼠海马Aβ沉积的分子机制可能和运动激活AMPK,改善海马能量代谢,继而调节AMPK-BACE1通路有关。

二苯乙烯苷对APP/PS1双转基因小鼠海马区病理形态学及脑BACE1表达的影响

目的观察二苯乙烯苷(TSG)对APP/PS1双转基因小鼠海马区病理形态学变化和脑组织中β-淀粉样前体蛋白裂解酶-1(BACE1)表达的影响,探讨其作用的可能机制,为临床应用提供实验依据。方法 50只3月龄APP/PS1双转基因小鼠,随机分为TSG低剂量(0.033g·kg-1·d-1)组、TSG中剂量(0.1g·kg-1·d-1)组、TSG高剂量(0.3g·kg-1·d-1)组、石杉碱甲(阳性对照)组及模型组,正常对照组为10只同龄C5B7L/6J小鼠。各组给予60d相应药物后,苏木精-伊红(HE)染色法观察海马区病理形态学变化;用Western blotting法检测小鼠脑组织BACE1蛋白表达水平。结果与模型组相比,各治疗组小鼠海马区形态均有不同程度的改善;BACE1表达水平均显著降低(P<0.01)。TSG各剂量组BACE1的表达量与石杉碱甲组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TSG治疗阿尔茨海默病的机制可能与降低BACE1表达水平,减少β淀粉样蛋白(Aβ)产生,改善神经元损伤等有关。

循环酶法同型半胱氨酸检测关键酶CBS和CBL的开发及试剂盒研制初探

以酿酒酵母基因组为模板通过PCR分别扩增胱硫醚β合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)和胱硫醚β-裂解酶(cystathionine β-lyase,CBL)目的基因片段,经无缝克隆构建表达质粒并转化大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)。经诱导表达和纯化后,重组蛋白的纯度均达到90%,回收率均达到80%,可溶表达量分别为26 mg/L和332 mg/L。经催化活性测定,CBS的单位酶活为15 U/mg,CBL的单位酶活为72 U/mg。在此基础上初步开发了循环酶法同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)检测试剂盒,实验结果证明该试剂盒的有效性和稳定性均符合体外诊断检测的要求,其检测性能与市售进口同类试剂盒基本一致。

阿尔茨海默病患者血清miR-19b-3p表达与认知功能的关系

目的探索阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）患者血清差异表达的miRNAs及其与认知功能的关系。方法采用Illumina／Solexa高通量测序技术分析AD患者和健康体检老年人两组（各30例）血清miRNA表达谱；构建miRNA慢病毒质粒，注射至造模成功的AD大鼠静脉内，采用水迷宫实验分析大鼠的认知功能；合成miRNA模拟剂（nfimics）、抑制剂（inhibitor），转染至SH—SY5Y细胞系中，采用Westernblot法检测细胞中β-淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACEl）的表达。结果与正常对照组（contr01）相比，AD组血清中miR-146a-5p（10g2AD／Control=2．3）、miR-195—5p（10g2AD／Con-trol=10．2）、miR-20b-5p（10g，AD／Control=15．1）表达上调，miR-19b-3p（10g2AD／Control=-8．0）、miR-125b-3p（10g，AD／Control=-153）表达下调，差异有统计学意义（P〈0．05）；与AD组[（26．50±3．12）s]相比，AD＋miR-19b-3p组[（15．33±2．78）S]的大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义（P〈0．05）；与正常对照相比，miR-19b-3p模拟剂组BACEl蛋白表达减少，抑制剂组BACEl蛋白表达增加。结论nliR-19b-3p可能通过调节BACEl的表达改善AD患者的认知功能。