Wnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞及对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响

背景:Wnt信号通路是动物胚胎发育过程中重要的调控通路,建立Wnt信号通路细胞模型对于研究该通路有重要意义。目的:以Wnt3a真核表达质粒转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞,构建能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,观察经典Wnt信号通路对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响。方法:将扩增真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0进行酶切鉴定。应用脂质体转染技术将真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0和对照质粒pgk-neo-pcDNA3.0转染入胸腺激酶缺陷细胞,经过G418筛选后挑出细胞克隆,扩大培养。应用RT-PCR技术检测表达产物,应用间接免疫荧光技术检测Wnt3a对鼠胸腺激酶缺陷细胞β-catenin亚细胞分布的影响。结果与结论:Wnt3a质粒经过酶切鉴定证明所扩增的质粒为目的质粒。经过G418筛选3周后,挑选10个稳定转染的细胞克隆,进行RT-PCR检测,可见在L-Wnt3a细胞的cDNA产生1条长度为320bp亮带,表明扩增产物为所需要的目的片段,Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后有Wnt3a在mRNA转录水平表达。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞cDNA未扩增出目的条带。免疫荧光检测可见Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后细胞浆中有Wnt3a蛋白表达,转染对照质粒组无表达。Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞核中可见明亮的红色荧光,提示β-连环素蛋白在胸腺激酶缺陷细胞-Wnt3a细胞聚集并进入细胞核中。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞浆未见有明显β-连环素蛋白着色,细胞核中无β-连环素蛋白的聚集。构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,真核表达Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞能够获得稳定表达,促进胸腺激酶缺陷细胞浆中β-连环素蛋白向细胞核转移。

β-连环素蛋白预测分化型甲状腺癌转移的价值

目的探讨β-连环素蛋白预测分化型甲状腺癌转移的临床价值。方法选取2013年2月至2019年10月华中科技大学协和深圳医院收治的423例分化型甲状腺癌患者,其中男123例,女300例;组织学类型:乳头状癌297例,滤泡癌126例;TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期232例,Ⅲ~Ⅳ期191例,根据术后组织病理结果,将患者分为转移组(73例)和未转移组(350例)。免疫组化法检测癌组织中β-连环素蛋白表达情况,比较两组患者的临床病理参数及β-连环素蛋白评分,应用ROC曲线分析β-连环素蛋白评分预测分化型甲状腺癌转移的临床价值,应用多因素Logistic回归分析分化型甲状腺癌转移的影响因素。结果β-连环素蛋白在癌组织中主要表达于细胞膜上。转移组的β-连环素蛋白半定量评分明显高于未转移组[(6.61±1.82)分vs.(3.60±1.11)分],差异有统计学意义(t=13.612,P<0.001);且两组患者的年龄、肿瘤直径、病灶位置及TNM分期等差异有统计学意义(P<0.05)。β-连环素蛋白表达与肿瘤直径、TNM分期及腺外侵犯相关(P<0.05),与性别、年龄、组织学类型及病灶位置等无关(P>0.05)。根据ROC曲线,β-连环素蛋白评分诊断分化型甲状腺癌转移的最佳临界值为4.08分,敏感度为65.75%,特异度为69.43%,ROC曲线下面积(AUC)为0.708(95%CI:0.645~0.772),具有一定的预测价值。Logistic回归分析结果显示,β-连环素蛋白评分>4.08分(OR=1.824,95%CI:1.315~2.530)、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期(OR=1.735,95%CI:1.105~2.723)及肿瘤直径>1.0 cm(OR=1.523,95%CI:1.207~1.924)是分化型甲状腺癌转移的独立危险因素(P<0.05)。结论β-连环素蛋白在分化型甲状腺癌中异常表达,对预测甲状腺癌转移有一定的临床价值。

β-连环素蛋白与神经细胞黏附分子在甲状腺癌中的表达及相关性分析

目的探究β-连环素蛋白(β-ceatenin)与神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule ,NCAM)在甲状腺癌的表达及两者的相关性。方法选取2012年12月至2017年12月浙江中医药大学附属温州中西医结合医院普外科收治的62例甲状腺癌组织及同期行手术切除的44例甲状腺腺瘤组织,采用免疫组化染色法检测NCAM及β-catenin在甲状腺癌组织和甲状腺腺瘤组织的表达水平,并分析NCAM及β-catenin的表达水平与甲状腺癌患者临床病理特征的关系及两者的相关性。结果NCAM在甲状腺癌组织的阳性表达率(12.90%)明显低于甲状腺腺瘤组织(90.91%),差异具有统计学意义(t=63.203 ,P=0.000);β-catenin蛋白在甲状腺癌组织的阳性表达率(82.26%)明显高于甲状腺腺瘤组织(6.82%),差异具有统计学意义(t=58.608,P=0.000);NCAM与β-catenin在甲状腺癌中的表达呈负相关(r=-0.220, P=0.024);性别,年龄、肿瘤直径、组织学类型、病理分期不同的甲状腺癌患者,癌组织中NCAM表达水平差别不显著,差异无统计学意义(t=1.960、0.054 3.335、0.807、0.218,P=0.162、0.816、0.069、0.848、0.641);淋巴结转移情况不同的甲状腺癌患者,癌组织中NCAM表达水平差别显著,差异具有统计学意义(t=8.373,P=0.004);性别、组织学类型、肿瘤直径、年龄、淋巴结转移情况、病理分期不同的甲状腺癌患者,癌组织中B-catenin表达水平差别不显著,差异均无;统计学意义(t=0.258、2.307、0.424、0.741、2.570、0.126,P=0.612、0.511、0.515、0.389、0.109、0.722)。结论NCAM在甲状腺癌中呈低表达,β-catenin在甲状腺癌中呈高表达,NCAM与β-catenin在甲状腺癌中的表达呈负相关,且NCAM的表达与甲状腺癌患者淋巴结转移情况呈相关性。

β-连环素互作蛋白1参与PPARγ转录活性调控及在高糖诱导系膜细胞表型转化中的作用

目的探讨β-连环素互作蛋白1(β-catenin-interacting protein 1,ICAT)在过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)转录活性调控中的作用及在高糖诱导系膜细胞表型转化中的意义。方法将人肾小球系膜细胞分别用常规葡萄糖浓度(5.5 mmol/L,对照组)和高糖(30 mmol/L,高糖组)培养48 h,检测PPARγ、ICAT和β-catenin的mRNA及蛋白质表达变化。观察过表达ICAT和敲减ICAT及β-catenin对上述培养条件下系膜细胞PPARγ转录活性的影响。利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术检测不同分组中细胞表型转化标志物平滑肌动蛋白α(α-smooth muscular actin,α-SMA)表达水平。利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖水平。结果与对照组比较,高糖培养可诱导系膜细胞表型标志蛋白α-SMA的表达上调以及系膜细胞增殖;高糖培养虽对系膜细胞PPARγ蛋白表达水平无影响(P>0.05),但可使PPARγ转录活性明显降低(P<0.01),同时,可抑制系膜细胞ICAT表达和促进β-catenin表达;过表达ICAT可部分升高高糖培养的系膜细胞PPARγ的转录活性(P<0.01);在常规糖浓度条件下,敲减ICAT可降低PPARγ的转录活性(P<0.01),敲减β-catenin表达,同样可降低PPARγ的转录活性(P<0.01);高糖培养条件下,过表达ICAT可抑制系膜细胞α-SMA的表达与细胞增殖。结论 ICAT可能是PPARγ转录活性的重要调控分子之一,并参与介导了高糖诱导系膜细胞表型转化。

基于PI3K/Akt通路探讨健脾清热活血方含药血清对人结肠癌SW480细胞增殖、凋亡、周期及P-β-catenin表达的影响

目的:观察健脾清热活血方对人结肠癌SW480细胞凋亡、增殖、周期及P-β-catenin蛋白的影响,探讨该方防治结肠癌可能机制。方法:培养人结肠癌SW480细胞,分别予空白胎牛血清、不同浓度健脾清热活血方含药血清及PI3K阻断剂LY294002干预24 h,MTT法及流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及细胞周期,免疫荧光染色法检测P-β-catenin核内转位。结果:健脾清热活血方含药血清组细胞增殖抑制率及凋亡率显著高于空白对照组(P<0.05);同时S期细胞比例显著升高、G1期细胞比例显著降低(P<0.05)。健脾清热活血方含药血清组及LY294002组细胞P-β-catenin以膜表达为主,而空白对照组P-β-catenin以膜表达缺失及核内表达增加为主。结论:健脾清热活血方可能通过调控P-β-catenin核内转录,阻滞SW480细胞周期于G1期,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,从而发挥防治结肠癌的效用。

散癖平胃方剂对人胃癌细胞株增殖和凋亡的影响

目的 探讨中药散癖平胃方剂（SPPW）对人胃癌细胞株增殖和凋亡的影响。方法 体外培养人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823，设立3个SPPW质量浓度组（10、100、1000μg/mL）、阴性对照组和5-FU阳性对照组进行干预，MTT比色法检测干预不同时间后各组吸光度（A）值；流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡；透射电镜观察细胞超微结构的改变；Western blot法检测β-连环素蛋白（β-catenin）表达变化。结果 与阴性对照组相比，SPPW作用于胃癌细胞株SGC-7901及BGC-823 12～72h后，对细胞增殖均有抑制作用（P〈0.01）；SPPW干预胃癌细胞株SGC-7901 48h后能促进细胞凋亡，透射电镜下表现出明显的凋亡形态学改变；Western blot法检测β-catenin蛋白表达呈浓度依赖性下降，差异具有统计学意义（P〈0.01）。结论 SPPW可以明显抑制人胃癌细胞株的增殖和促进细胞凋亡，为SPPW的临床应用提供了可靠的理论基础。

HIF-1α、β-catenin蛋白在结肠癌组织中的表达及其与临床病理的关系

为分析HIF-1α、β-catenin蛋白在结肠癌组织中的表达及其与临床病理的关系,选取我院2017-2018年收治的结肠癌患者80例。使用腹腔镜获取结肠癌组织标本80份,将其纳入病例组;另获取结肠癌旁正常组织80份,将其纳入对照组,采用免疫组化方法检测2组结肠组织中HIF-1α、β-catenin表达,问卷调查统计患者性别、年龄、肿瘤直径、分期、分化程度、淋巴结转移情况等。结果显示,病例组HIF-1α阳性率、β-catenin异位率高于对照组(P<0.05)。结肠癌组织HIF-1α、β-catenin表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、合并症无关(P>0.05),与TNM分期、分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)。结肠癌组织中HIF-1α与β-catenin表达具有显著正相关性(P<0.05)。结果表明,HIF-1α、β-catenin蛋白与结肠癌发生、发展密切相关,二者均参与了结肠癌淋巴转移和肿瘤发展过程。