刺齿报春苣苔酮脂酰-辅酶A合成酶基因的鉴定及序列分析

【目的】为进一步探讨刺齿报春苣苔酮脂酰-辅酶A合成酶基因的分子结构和功能,并为刺齿报春苣苔适应极端干旱环境提供分子依据。【方法】总RNA的提取采用改良Trizol法,通过转录组测序获得与刺齿报春苣苔( Primulina spinulosa )抗旱及应对生物胁迫反应有关的基因:酮脂酰-辅酶A合成酶基因,并运用DNAman、Finder、TMPRED、SWISS-MODEL、NetPhos2.0、SignaIP4.1等软件对序列的开放阅读框(ORF)、编码氨基酸、编码蛋白质等理化特性进行分析,并构建系统发育树。【结果】序列分析结果表明,该基因全长1 935 bp(GenBank登录号为MH543314),开放阅读框(ORF)为1 599 bp,共编码532个氨基酸,编码蛋白质的分子量为59.82 kDa,理论等电点(pI)为9.16,为亲水性蛋白,含7个跨膜区,30个可能的磷酸化位点,1个与查尔酮合成酶家族蛋白相同的保守结构域;它与同科旋蒴苣苔( Dorcoceras hygrometricum, KZV37788)的同源性高达92%,两者在系统进化树上聚为一支。【结论】酮脂酰-辅酶A合成酶基因与刺齿报春苣苔叶表面的蜡质合成有关,对植物的抗旱及应对生物胁迫发挥重要调控作用。

强化乙酰辅酶A供给对解脂亚洛酵母产α-酮戊二酸的影响

本实验室前期通过筛选得到一株高产α-酮戊二酸的菌株,命名为解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06,以100 g/L甘油为唯一碳源,摇瓶发酵144 h后,α-酮戊二酸产量可达35 g/L左右,但是发酵液中会同时积累一定量的副产物—丙酮酸,增加了后提取等环节的成本,不利于工业化大规模生产。本研究通过外源添加一定量的乙酸钠来促进胞内乙酰辅酶A的合成。通过提高胞内乙酰辅酶A供给,加大碳代谢流从丙节点流向三羧酸循环,从而促进α-酮戊二酸的生成。此外,通过实时定量PCR技术研究添加乙酸钠前后,胞内与α-酮戊二酸合成相关的关键基因的转录变化,为揭示乙酸钠促进α-酮戊二酸合成的机理提供一定的理论依据。为了进一步验证乙酸钠对α-酮戊二酸合成的影响,在3一L发酵罐上添加4 g/L乙酸钠,α-酮戊二酸的最终产量可达51.6g/L,比对照(不添加乙酸钠)提高了22.6%,丙酮酸产量为26.2 g/L,比对照降低了26.0%。

3-酮脂酰辅酶A硫解酶家族的分子特征、调节与药物靶向治疗

3-酮脂酰辅酶A硫解酶(3-ketoacyl CoA thiolase,3-KAT)是一类在脂肪酸β-氧化裂解反应中扮演重要角色的酶,包括线粒体型和过氧化物酶体(peroxisome)型,二者分别由不同基因编码.在线粒体该酶催化中长链及短链脂肪酸彻底裂解为乙酰辅酶A;在过氧化物酶体其底物则为极长链脂肪酸(≥C22)、长链脂肪酸和支链脂肪酸,经过有限的β氧化循环,缩短碳链,之后产物进入线粒体继续氧化(图1).3-KAT是脂肪酸β-氧化最后一步,其活性的高低直接影响心肌对底物脂肪酸与糖的选择性及氧的利用效率.另在秀丽隐杆线虫观察到,该酶具有抗衰老作用,是去乙酰化酶Sirt2.1抗衰老的关键下游分子[1].3-KAT在机体中的重要性使得有必要多角度阐释其分子特征.

侧柏总黄酮的分离纯化及对5-脂氧合酶的抑制作用

目的 从侧柏叶中分离纯化活性成分总黄酮并探讨其对5-脂氧合酶的抑制作用.方法 石油醚加热回流除去大部分叶绿素等脂溶性杂质,再用体积分数为50%乙醇加热回流提取;提取液浓缩去除乙醇后用乙酸乙酯提取,减压浓缩得粗黄酮;粗黄酮过聚酰胺色谱柱,用体积分数为70%的甲醇洗脱,浓缩得总黄酮;高效液相色谱法测定大鼠中性白细胞5-脂氧合酶的产物5-羟廿碳四烯酸,Fura-2/AM荧光技术测定细胞内游离钙浓度.结果 用芦丁作参照品,测得分离的产物总黄酮含量为93%,总黄酮对5-脂氧合酶抑制的IC50为22.2;25～125 mg·L^-1的总黄酮对fMLP诱导的细胞内游离Ca^2＋水平增高抑制率为15.2%～35.9%.结论 该方法较简单,分离的总黄酮纯度高,是一种可行的总黄酮提取方法;侧柏总黄酮对5-脂氧合酶的活性有较强的抑制作用,抑制细胞内游离Ca^2＋水平增高可能是抑制5-脂氧合酶的作用机制之一.

青心酮对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞5-脂氧合酶的影响

目的观察青心酮防治ApoE(-/-)小鼠主动脉粥样硬化病变(atherosclerosis,AS)与5-脂氧合酶的关系。方法传代培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7,分成4组:正常对照组,模型组,青心酮组,辛伐他汀组。收集各组细胞蛋白,应用Western-blot检测5-脂氧合酶含量;收集上清液,用ELISA检测白三烯B4(leukotrieneB4,LTB4)。以C57BL/6小鼠作正常对照组,24只雄性ApoE(-/-)小鼠随机分成3组:模型组(等量乙醇),青心酮治疗组(20 mg·kg-1·d-)1,辛伐他汀治疗组(20 mg·kg-1·d-)1,给药8周。所有实验小鼠饲以普通饲料至16周。取血检测LTB4,剪取主动脉根部行组织切片,HE染色观察主动脉粥样硬化病变情况;剪取主动脉根部斑块组织,Western blot法测定斑块中5-脂氧合酶水平。结果青心酮处理后LTB4降低,5-脂氧合酶含量减少,AS病灶形成数目、面积减少。结论青心酮能减轻ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化病变,可能与其抑制5-脂氧合酶,减少LTB4有关。

蒜头果中3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆与表达分析

以蒜头果(Malania oleifera)为实验材料,基于转录组数据分析,采用RT-PCR方法获得蒜头果3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因的cDNA序列,命名为MoKCS1,GenBank登录号为MK210592。序列分析显示MoKCS1基因cDNA全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,属于KCS家族。序列比对分析显示Mo KCS1拥有KCS家族特有的3个功能保守结构域,与榴莲(Durio zibethinus) KCS的蛋白序列同源性为80. 66%;与已知超长链KCS蛋白进行系统进化分析显示,MoKCS1独立形成一个分支。荧光定量PCR分析表明,MoKCS1在蒜头果果实膨大期的表达量最高,而在叶中几乎不表达。

杜氏盐藻β-酮酯酰-ACP合酶(DsKASⅡ)基因的分离及功能分析

酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)是催化棕榈酸(16∶0-ACP)延伸为硬脂酸(18∶0-ACP)的关键酶,其活性强弱决定着18碳脂肪酸含量的高低。本文以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为试材,分离鉴定杜氏盐藻DsKASⅡ基因编码序列,采用生物信息学工具解析DsKASⅡ酶蛋白的亚细胞定位、高级结构、理化性质及系统发育等特性。检测氮胁迫下的DsKASⅡ表达量,以及藻细胞脂肪酸、叶绿素和β-胡萝卜素的含量。结果表明,DsKASⅡ编码的酶蛋白长度为476 aa,pI为6. 99,含叶绿体靶向肽和较多亲水区。二级结构主要由α-螺旋(22. 48%),β-片层(22. 06%)和无规则卷曲(55. 46%)组成。三级结构预测表明该蛋白整体呈紧密的心形结构,活性酶蛋白为同源二聚体。系统发育分析表明,DsKASⅡ氨基酸序列与莱茵衣藻CrKASⅡ同源性达99%,可能二者有着共同的进化祖先。qRT-PCR揭示,与正常培养的杜氏盐藻相比,DsKASⅡ在氮胁迫条件下的表达量明显上调,第3天时的表达量比正常培养的高4. 5倍。氮胁迫下藻细胞总油脂、油酸(C18∶1)和类胡萝卜素含量显著提高,然而棕榈酸(C16∶0)和叶绿素的含量明显降低。这表明,氮胁迫诱导杜氏盐藻DsKASⅡ基因上调表达,将更多的棕榈酸催化为硬脂酸,进而提高了单不饱和油酸的富集以及类胡萝卜素的积累。本研究为后续进一步解析杜氏盐藻氮胁迫条件下,油脂与胡萝卜素合成积累及藻细胞响应胁迫机制和优质富油藻种培育提供了科学参考。

硬脂酰辅酶A去饱和酶-1在肝脏脂质代谢中的作用及其调节

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)在肝脏等脂质代谢中起重要作用,此文就其在肝脏脂质代谢中的作用,以及饮食、维生素和过氧化物酶体对SCD的调节进行综述。

滇牡丹3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆与功能分析

3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase,简称KCS)是超长链单不饱和脂肪酸生物合成途径的关键酶。依据转录组数据设计特异性引物,使用RT-PCR方法从滇牡丹(Paeonia delavayi)中克隆得到1个KCS基因的cDNA全长序列,命名为PdKCS(Gen Bank登录号KX524949)。生物信息学分析结果表明,PdKCS基因片段序列全长1527 bp,包含完整的cDNA开放阅读框(ORF),编码含有502个氨基酸残基的蛋白质;Blast比对结果显示,该蛋白质属于KCS蛋白家族;系统进化分析结果显示,该蛋白质属于跨膜、亲水性蛋白;RT-PCR结果显示,其在种子中的表达随着种子的成熟出现双峰型的表达量变化。研究结果可为进一步研究该蛋白的调控机制提供理论依据及获得含高不饱和脂肪酸转基因滇牡丹品种奠定理论基础。

支气管肺发育不良早产儿外周血清5-脂氧合酶激活蛋白、白三烯C4合成酶及半胱氨酰白三烯受体1的表达研究

目的:探讨新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)及支气管肺发育不良(bronchopul-monary dysplasia,BPD)患儿血清中5-脂氧合酶激活蛋白(5-lipoxygenase activating protein,FLAP)、白三烯C4合成酶(leukotriene C4 synthase,LTC4S)及半胱氨酰白三烯受体1(cysteinyl leukotriene receptor 1,CysLTR1)水平变化的意义,旨在寻找BPD早期敏感的生物学指标。方法:收集2015年8月—2017年12月在南京医科大学第一附属医院儿科收治入院的胎龄<37周、出生体重<2 500 g的新生儿病例。待其出院后根据患儿完整住院信息将病例整理为无肺部疾病的早产儿65例(对照组),不合并BPD的NRDS早产儿60例(NRDS组),BPD早产儿49例(BPD组)。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测新生儿生后3、7、14 d血清中FLAP、LTC4S、CysLTR1水平。比较3组各时间点各指标的浓度水平,采用方差分析、t检验及卡方检验等进行统计学分析。结果:生后3 d BPD组血清FLAP、CysLTR1水平均高于对照组和NRDS组(P均<0.05)。生后7 d BPD组血清FLAP、LTC4S、CysLTR1水平均高于对照组(P均<0.05),BPD组血清FLAP和CysLTR1水平分别高于NRDS组(P <0.05)。生后14 d BPD组仅血清LTC4S水平高于对照组(P <0.05)。结论:生后3 d血清PLAP、CysLTR1水平,生后7 d血清FLAP、LTC4S和CysLTR1水平,生后14 d血清LTC4S水平可作为BPD早期诊断的生物学指标。

5-脂氧合酶／半胱氨酰白三烯通路在脑损伤中的作用

由细胞膜磷脂来源的炎症介质种类很多，其中，对花生四烯酸(arachidonic acid，AA)经环氧合酶(cyclooxygenase，COX)催化生成的前列腺素类，了解得较多，并且有较多COX抑制剂用于临床。但是，对脂氧合酶(lipoxygenase，LO，包括5-LO、12-LO、15-LO)催化生成的产物相对了解较少，特别对它们在脑内的作用尚知之不多。本文对5-LO及其产物CysLTs的特点以及我们对此的研究结果，作一归纳。

射干异黄酮成分对5-脂氧合酶的作用研究

目的:考查射干中鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素及白射干素单体成分对脂氧合酶5-LOX的影响。方法:采用脂氧合酶5-LOX抑制剂体外筛选模型进行,计算各成分对5-LOX酶的抑制率。结果:各单体成分对5-LOX均有一定的抑制作用,其中野鸢尾黄素抑制率近100%,鸢尾黄素91.7%,野鸢尾苷50%。结论:射干异黄酮单体可能通过抑制5-LOX途径发挥抗炎作用。

哮喘患儿外周血半胱氨酰白三烯水平及5-脂氧合酶激活蛋白mRNA基因表达水平及其临床意义

目的探讨哮喘患儿外周血半胱氨酰白三烯(Cys LTs)水平及5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)mRNA基因表达水平及其临床意义。方法哮喘患儿(5岁及以下)40例,按病情等级划分轻、中、重、危重组,另外选取10名健康儿童作对照组。哮喘患儿随机分为常规治疗组及白三烯(LTs)拮抗剂干预组,每组20例。分别于入院24 h内、治疗第10天、3个月、1年、2年抽取外周血测定Cys LTs水平及FLAP mRNA/β-action mRNA的相对数值,并记录患儿病情等级和疗效情况。结果哮喘患儿的入院时Cys LTs水平及FLAP mRNA/β-action mRNA的相对数值均高于对照组(P<0.05),Cys LTs水平及FLAP mRNA/β-action mRNA与病情程度呈正相关性(P<0.05)。治疗第10天、3个月、1年及2年,LTs拮抗剂干预组的病情分级均轻于常规治疗组,但差异无统计学意义(P>0.05),疗效均优于常规治疗组(P<0.05);在治疗后各观察时间点,LTs拮抗剂干预组Cys LTs水平及FLAP mRNA/β-action mRNA的相对数值均显著低于常规治疗组(P<0.05)。结论 Cys LTs及FLAP mRNA水平与哮喘的病情呈正相关性,Cys LTs可能成为研究哮喘发病和药物治疗的重要指标;采用LTs拮抗剂联合ICS治疗患儿哮喘具有协同作用,有效控制Cys LTs及FLAP mRNA水平。

羟酰辅酶A脱氢酶在癌中作用机制的研究进展

脂肪酸代谢与癌的发生发展之间存在密切联系。羟酰辅酶A脱氢酶(HADH)作为脂肪酸β-氧化的关键酶,近年来被发现在多种癌中为抑癌因子,在急性髓系白血病等中为促癌因子。在癌细胞中,HADH除直接催化脂肪酸β-氧化外,还间接作用于PPAR、TNF-α、JAK-STAT3、PI3K/Akt、IFN-γ、MAPK与非经典Wnt等多种信号通路,影响癌细胞增殖与迁移。HADH作为不同种癌诊断、治疗和预后的潜在肿瘤标志物,具备较高临床应用价值。

脂多糖对奶牛输卵管上皮细胞环氧合酶-2基因表达的调控作用

本试验旨在探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对奶牛输卵管上皮细胞环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因表达的影响,阐明LPS对奶牛输卵管上皮细胞COX-2基因表达的调控机制。采用机械法及胰酶消化法分离培养奶牛输卵管上皮细胞;分别将LPS、吲哚美辛、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作用于体外培养的奶牛输卵管上皮细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测LPS对奶牛输卵管上皮细胞COX-2基因表达的调控作用。结果显示,不同浓度的LPS能显著促进输卵管上皮细胞COX-2mRNA的表达(P<0.05),且具有浓度依赖性;LPS作用2h时COX-2mRNA的表达量最高,随之表达量逐渐下降到正常水平;NAC能显著抑制LPS诱导的COX-2mRNA表达(P<0.05)。结果表明,LPS能通过NF-κB途径上调奶牛输卵管上皮细胞COX-2mRNA表达量。

吡格列酮对脂多糖所致大鼠海马损伤的保护作用及其对iNOS和IL-1β表达水平的影响

目的研究过氧化体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂吡格列酮(pioglitazone,pio)对大鼠脑室注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致海马损伤的保护作用及对诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达水平的影响。方法雄性大鼠40只,随机分为4组,每组10只,即对照组,LPS模型组,LPS+Pio 40mg/kg组和LPS+pio 80mg/kg组。大鼠灌胃给予pio(40,80mg/kg)3周,脑室内注射LPS(5μl,30μg)1周后,取脑组织,制成石蜡切片,进行尼氏(Nissl)染色和胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫组织化学染色,研究海马CA1区锥体神经元形态学改变和星形胶质细胞的活化、浸润情况。采用Western蛋白印迹检测方法观察IL-1β、iNOS的表达情况。结果大鼠脑室内注射LPS可引起海马CA1区星形胶质细胞的激活和浸润及椎体神经元的损伤,同时伴有IL-1β,iNOS的表达增加。Pio(40、80mg/kg连续应用1周)能减轻海马CA1区椎体神经元的损伤及星形胶质细胞的激活和浸润,抑制LPS引起的IL-1β、iNOS表达增加。侧脑室注射LPS后1周,LPS组大鼠海马CA1区IL-1β蛋白表达水平较对照组差异有统计学意义(P<0.01)。LSP+Pio 40mg/kg组和LSP+Pio 80mg/kg组大鼠海马CAI区IL-1β表达量较LPS模型组差别有统计学意义(P<0.01)。LSP+Pio 40mg/kg组和LSP+Pio 80mg/kg组大鼠海马CA1区iNOS表达量较LPS模型组差别有统计学意义(P<0.01)。结论Pio能够通过抑制LPS引起的IL-1β、iNOS的表达,减轻海马椎体神经元的损伤。

摩那克灵K，一种新低胆固醇剂，特别能抑制3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A还原酶

摩那克灵Ｋ，一种新低胆固醇剂，特别能抑制３－羟基－３－甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶真菌代谢产物摩那克灵Ｋ（ＭｏｎａｃｏｌｉｎＫ）作为一种新低胆固醇剂已在本实验室（１）从红色红曲（Ｍｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒ）培养物中被分离出。本化合物的化学结构（结构研究的细...

女贞子总黄酮对高脂模型大鼠脂代谢的影响

目的:研究女贞子总黄酮对高脂模型大鼠脂代谢的影响并探讨其作用机制.方法:以Triton诱导大鼠高脂模型,女贞子总黄酮以15,45,150mg/kg体质量给药3d,以苯扎贝特为阳性对照,生化方法检测总胆固醇(TC),三酰甘油(TG)水平,逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测肝组织脂蛋白脂酶(LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)及羟甲戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)mRNA的表达水平.结果:模型组TC,TG水平显著增高,PPARα,LPL表达明显降低,而HMGCR表达增强.女贞子总黄酮可显著降低TC,TG水平;促进PPARα,LPL的表达,抑制HMGCR的表达.结论:女贞子总黄酮对高脂模型大鼠脂代谢紊乱具有较好的调节作用,可能通过对PPARα-LPL通路以及HMGCR表达的调控来实现其降脂作用.

黄麻β-酮脂酰-CoA合酶(KCS)基因分离与功能鉴定

表皮蜡质层和角质膜对植物自我防护外界生物和非生物胁迫发挥重要调控作用,β-酮脂酰-CoA合酶(KCS)基因是表皮蜡质层中超长链脂肪酸合成反应中的限速酶,为揭示β-酮脂酰-CoA合酶与植物抗旱特性之间的关系,本研究从黄麻中分离了β-酮脂酰-CoA合酶(KCS)基因,该基因cDNA全长1 572 bp,编码523个氨基酸,将该基因正向插入植物表达载体(pCAMBIA2300)中,利用花絮侵染法转化拟南芥,通过PCR和Southern blotting分子检测表明,外源基因已整合到拟南芥基因组中,模拟干旱胁迫结果表明,过表达黄麻β-酮脂酰-Co A合酶基因的拟南芥与野生型相比,转化植物的根根毛数量、根长及抗旱性能有不同程度的提高。该研究结果为进一步解析β-酮脂酰-CoA合酶基因参与调控植物抗旱的分子机制提供指导。

小檗碱对3T3-L1脂肪细胞炎症因子、脂肪因子及脂肪酸代谢的影响

目的：观察小檗碱对3T3-L1脂肪细胞炎症因子、脂肪因子及脂肪酸代谢的影响，探讨小檗碱改善胰岛素抵抗的分子机制。方法3T3-L1脂肪细胞经不同浓度小檗碱（0、5、10、20和40μmol/L）处理24 h后，采用qRT-PCR技术检测相关因子mRNA表达水平，包括白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、瘦素、脂联素和内脂素以及脂肪酸合酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪组织甘油三酯水解酶（ATGL）、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（AFABP）。同时用10μmol/L小檗碱分别处理脂肪细胞0、4、8、24、48 h后，以相同方法测定上述指标mRNA表达水平。结果10-40μmol/L小檗碱剂量组的脂肪细胞内IL-6、TNF-α、瘦素、FAS、ATGL、AFABP mRNA表达水平均低于0μmol/L组，内脂素mRNA高于0μmol/L组（P〈0.05），各组间脂联素mRNA表达无明显差异（P〉0.05）。8-48 h时间处理组细胞内IL-6、TNF-α、瘦素、AFABP、ATGL、FAS mRNA表达水平均低于0 h组，内脂素mRNA水平高于0 h组（P〈0.05）。脂联素mRNA表达水平仅在48 h处理组降低（P〈0.05）。各组间ACC mRNA表达无明显差异（P〉0.05）。结论小檗碱能影响3T3-L1脂肪细胞炎症因子、脂肪因子和关键脂肪酶及蛋白mRNA的表达，且呈时间、剂量依赖效应，这可能是其改善胰岛素抵抗的重要分子机制。