白血病相关蛋白16调控Wnt/β-链蛋白通路对结肠癌细胞增殖、侵袭的影响

目的研究人白血病相关蛋白16(LRP16)调控Wnt/β-链蛋白(β-catenin)通路对结肠癌细胞增殖、侵袭的影响。方法将结肠癌HCT116细胞分为3组:空白组、阴性对照组、si-LRP16组。将si-LRP16阴性对照序列、si-LRP16分别转染至HCT116细胞,分别命名为阴性对照组和si-LRP16组,未经处理的细胞为空白组。用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定转染后HCT116细胞LRP16表达水平,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测转染后HCT116细胞增殖能力,Transwell小室实验检测转染后HCT116细胞侵袭能力,划痕实验检测转染后HCT116细胞迁移能力,蛋白印迹法(Western blot)测定转染后HCT116细胞中β-catenin表达水平。结果转染后,空白组、阴性对照组和si-LRP16组LRP16表达水平分别为2.17±0.18,2.15±0.19和1.55±0.27,HCT116细胞活性分别为(98.46±3.51)%,(97.92±5.07)%和(71.05±4.73)%;HCT116细胞体外侵袭细胞数分别为(54.90±10.52),(58.79±9.18)和(35.24±8.01)个,HCT116细胞体外迁移能力分别为(90.17±4.08)%,(89.54±6.94)%和(60.18±7.46)%。β-catenin表达水平分别为1.01±0.21,1.01±0.23和0.76±0.14。以上指标,si-LRP16组与空白组和阴性对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论抑制LRP16表达可抑制Wnt/β-catenin通路活性,从而降低HCT116细胞增殖、侵袭、迁移能力。

白头翁皂苷D对人乳腺癌MCF-7细胞中Wnt/β-链蛋白信号通路的影响

目的:研究白头翁皂苷D对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制效应及其机制。方法:不同浓度的白头翁皂苷D作用于人乳腺癌MCF-7细胞48 h后,CCK-8法检测细胞生存抑制率;Hoechst法检测细胞核凋亡变化;蛋白质印迹法检测MCF-7细胞内Wnt/β-链蛋白信号蛋白及下游组件蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达情况。结果:CCK-8法检测显示白头翁皂苷D可以抑制MCF-7细胞的增殖能力,细胞的生存抑制率呈药物浓度依赖性;Hoechst染色可见部分细胞核的形态发生改变,产生细胞核碎片,核发白等变化;与对照组比较,随着白头翁皂苷D浓度的增加,MCF-7细胞中β-链蛋白的蛋白表达量呈减少趋势;50 nmol·ml^(-1)的白头翁皂苷D诱导组细胞中Cyclin D1及c-Myc的蛋白表达量也明显减少(P<0.05)。结论:白头翁皂苷D可有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,其机制可能与抑制Wnt/β-链蛋白信号通路的激活,并抑制其下游蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达有关。

盘龙七片调节Wnt/β-catenin通路对大鼠胫骨骨折愈合的影响

目的探讨盘龙七片对大鼠胫骨骨折愈合的促进作用及可能作用机制。方法选用58只8周龄、SPF级SD雄性大鼠为实验大鼠,分为造模大鼠(n=48)与Sham组大鼠(n=10)。建立胫骨骨折模型大鼠,并将模型大鼠分为Model组、盘龙七片组(Treat组)、β-catenin抑制剂组(XAV-939)及盘龙七片+β-catenin抑制剂组(Treat+XAV-939组)4组,每组10只。X光片观察大鼠胫骨骨折愈合状况;骨密度测定仪检测胫骨骨矿物质密度值(BMD);HE染色观察大鼠骨折部位结构变化;酶联免疫吸附法检测血清中ALP、bFGF、TNF-α、IL-1β;免疫印迹法检测骨组织中p-糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、Wnt3、β-链蛋白(β-Catenin)及淋巴增强因子1(LEF1)蛋白表达。结果与Sham组相比,Model组骨组织影像学愈合评分、BMD、ALP、bFGF水平、Wnt3、β-Catenin、LEF1蛋白表达降低,TNF-α、IL-1β水平升高;与Model组相比,Treat组骨组织影像学愈合评分、BMD、ALP、bFGF水平、Wnt3、β-Catenin、LEF1蛋白表达升高,TNF-α、IL-1β水平降低;Treat+XAV-939组骨组织影像学愈合评分、BMD、ALP、bFGF水平、Wnt3、β-Catenin、LEF1蛋白表达高于XAV-939组,TNF-α、IL-1β水平低于XAV-939组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论盘龙七片可促进大鼠胫骨骨折愈合,其机制与抑制Wnt/β-catenin通路、缓解骨折大鼠机体炎症反应有关。

高良姜素通过抑制Wnt／β-链蛋白信号通路诱导胶质瘤细胞凋亡

目的探讨高良姜素对胶质瘤细胞体外增殖和凋亡的影响。方法（1）将胶质瘤细胞U251和U87分为空白对照组、DMSO组及高良姜素100、200、300、400μmol／L组，使用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法观察对胶质瘤细胞增殖情况；（2）通过Hoechest染色观察在不同浓度（0、100和200μmol／L）高良姜素作用下胶质瘤细胞U251和U87凋亡情况；（3）使用流式细胞仪检测胶质瘤细胞U251和U87在不同浓度（100和200μmol／L）高良姜素作用下凋亡情况；（4）应用Westernblotting技术检测凋亡相关蛋白B．链蛋白、B淋巴细胞瘤．2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关蛋白基因（Bax）、活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（活化caspase-3、活化caspase-9）、多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶（PARP）蛋白等在胶质瘤细胞U87和U251的表达。结果（1）在100、200、300、400μmol／L浓度的高良姜素作用下，体外培养的胶质瘤细胞U251和U87的增殖被明显抑制，并呈现一种量效关系。100、200、300、400μmol／L高良姜素作用于胶质瘤细胞U251和U8724h时，其半数抑制浓度分别为281、321、276、229μmol／L及289．4、261．1、247．4、225．3μmol／L。（2）胶质瘤细胞U251和U87随着高良姜素浓度增加（0、100和200μmol／L1，凋亡率也相应增加，差异具有统计学意义（P〈0．05）。（3）流式细胞仪检测细胞凋亡发现了同样的结果。（4）0、100、200μmol／L浓度高良姜素作用下，胶质瘤细胞U87和U251的Wnt／β-链蛋白表达依次减少，Bcl-2依次减少，Bax依次增加，活化caspase-3、活化caspase-9表达依次增多,活化PARP表达依次增加，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论高良姜素能抑制胶质瘤细胞U251和U87增殖，并通过Wnt／β-链蛋白信号通路及线粒体途径诱导其凋亡。

BMP-2与Wnt/β-catenin信号通路对间充质干细胞分化为成骨细胞的作用

目的探讨骨形成蛋白(BMP)2与Wnt/β-链蛋白(β-catenin)信号通路对间充质干细胞分化为成骨细胞的作用。方法将间充质干细胞C3H10T1/2分为五组:A组用正常培养基培养,B组用成脂诱导液IFMD(含有吲哚美辛10μg/ml、10%FBS、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤0.5mmol/L和地塞米松1mmol/L)处理,C组在IFMD处理的同时加入BMP-2 100ng/ml,D组在IFMD处理的同时加入氯化锂(LiCl)20mmol/L,E组在IFMD处理的同时加入BMP-2 100ng/ml和LiCl 20mmol/L。处理第8天,用ALP染色及油红O染色鉴定成骨细胞及脂肪细胞的分化情况;处理第2、4、8天,检测Ⅰ型胶原(Col1a1)、骨钙素(Ocn)以及CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白(aP2)和葡萄糖转运蛋白4(Glut4)的表达;重亚硫酸盐测序法检测C/EBPα在各组细胞中启动子区甲基化情况。结果A组无ALP及油红O阳性细胞,B组有大量油红O染色阳性细胞,E组细胞ALP活性最高。与B组比较,C组和E组Runx2、Col1a1和Ocn mRNA表达较高(P<0.05或P<0.01),C组、D组和E组C/EBPα、aP2和Glut4mRNA表达较低(P<0.05或P<0.01)。E组C/EBPα启动子区出现较高的甲基化水平,经5-氮杂胞苷处理后,C/EBPαmRNA表达升高(P<0.01),大部分细胞分化为脂肪细胞。结论在易成脂的病理微环境中,BMP-2和Wnt/β-catenin信号通路单独作用均不能有效促进成骨细胞分化,需要两者协同作用才能使间充质干细胞分化为成骨细胞,具体机制与C/EBPα启动子区甲基化有关。

左归丸对去势骨质疏松模型大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:观察左归丸对去势骨质疏松大鼠模型骨代谢和Wnt/β-链蛋白(β-catenin)信号通路的影响,探讨左归丸防治骨质疏松症的分子生物学机制。方法:采用双侧卵巢切除法制备绝经后骨质疏松症大鼠模型,60只雌性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,雌二醇组(戊酸雌二醇片0.05 mg·kg^(-1)·d^(-1)),左归丸低、中、高剂量组(5.5,11,22 g·kg^(-1)·d^(-1))。从造模成功后(第13周)开始,每日灌胃(ig)1次,共持续12周。给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠股骨组织结构变化;双能X射线仪检测各组大鼠股骨骨密度(BMD)和骨矿质(BMC);MTS Acumen3型生物力学测试系统检测各组大鼠骨生物力学性能;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中骨碱性磷酸酶(BALP),骨钙素(BGP),抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP),Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)等骨代谢标志物含量及雌二醇(E2)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠胫骨组织中Wnt2,β-catenin,低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)水平及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠BMD,BMC,最大载荷和刚度显著降低(P<0.01),血清E2和PINP含量显著降低(P<0.01),BALP,BGP,TRAP含量显著升高(P<0.01),骨组织中Wnt2,p-GSK-3βSer9,LRP5和β-catenin蛋白表达水平显著降低(P<0.01),股骨骨小梁稀疏变细,数量减少;与模型组比较,雌二醇组和左归丸各组BMD,BMC,最大载荷和刚度明显升高(P<0.05,P<0.01),血清E2和PINP含量明显升高(P<0.05,P<0.01),BALP,BGP,TRAP含量显著降低(P<0.01),骨组织中Wnt2,p-GSK-3βSer9,LRP5,β-catenin蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),股骨骨小梁较模型组变粗,数量增加,结构基本清晰。结论:左归丸对去势大鼠骨质疏松症具有一定的防治作用,其机制可能与提高雌激素水平,激活Wnt/β-catenin信号通路,上调Wnt2和LRP5蛋白表达,抑制GSK-3β的活性,减少β-catenin的降解,协调骨形成与骨吸收的动态耦联平衡,纠正骨代谢紊乱,从而改善骨组织形态相关。

益肺解毒汤对人肺腺癌A549细胞侵袭迁移的影响及相关机制

目的:观察益肺解毒汤对肺癌A549细胞侵袭转移的影响,并探讨该方对细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法:常规培养肺癌A549细胞,Co Cl2化学模拟肺癌A549细胞缺氧微环境,设空白组,以150μmol·L^(-1)Co Cl2,150μmol·L^(-1)Co Cl2+15 g·L^(-1)益肺解毒汤,15 g·L^(-1)益肺解毒汤处理细胞,镜下观察细胞形态学改变,transwell实验观察细胞侵袭能力;细胞划痕实验测细胞迁移能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定A549细胞上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中上皮细胞、间质细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达,转录因子Snail蛋白表达,信号分子β-链蛋白(β-catenin)、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-gsk-3β)表达。结果:缺氧可诱导A549细胞发生形态改变,益肺解毒汤可抑制缺氧诱导的形态改变。与空白组比较,Co Cl2组细胞侵袭和迁移能力增强(P<0.05);与Co Cl2组比较,Co Cl2+益肺解毒汤组的细胞侵袭能力明显减弱(P<0.01),迁移能力亦减弱(P<0.05)。与空白组比较,Co Cl2组细胞EMT相关蛋白,E-cadherin表达下调,Vimentin,Snail表达上调(P<0.05),说明缺氧使细胞发生了EMT;与Co Cl2组比较,Co Cl2+益肺解毒汤组可上调Ecadherin,p-gsk-3β,下调Vimentin,Snail,β-catenin蛋白表达(P<0.05)。结论:益肺解毒汤能抑制缺氧诱导的A549细胞的形态变化、侵袭及迁移能力,还能抑制缺氧诱导的EMT的发生,其机制可能与Wnt/β-catenin通路有关。

左归丸治疗骨质疏松症相关机制

左归丸是中医经典方剂之一，为“阳中求阴”的代表方，具有滋肾补阴的功效和纯补无泻的特点。骨质疏松症是一种以骨量低，骨组织结构破坏，导致骨脆性增加，骨强度下降及骨折风险增加，易发生骨折为特征的全身性骨病，它已成为威胁人类健康的常见疾病之一。中医学有“肾藏精，主骨生髓”的理论，左归丸在治疗骨质疏松症方面有着较好的临床疗效，同时也具有较少的副作用。近年来，针对左归丸治疗骨质疏松症的实验研究数量与日俱增，相关分子以及信号通路的机制研究亦取得一定拓展，特别是左归丸治疗骨质疏松症的相关机制研究陆续涌现。本研究通过整理左归丸治疗骨质疏松症的文献，对其作用机制及信号通路，包括环腺苷酸（cAMP）／蛋白激酶（PKA）／cAMP应答元件结合蛋白（CREB）通路，Notch信号通路，转化生长因子巾，（TGF-卢，）／Smad信号通路，Wnt／卢一链蛋白（卢一catenin）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等方面做一综述。这些研究表明左归丸治疗骨质疏松症具有多靶点、多途径的干预特点。虽然左归丸治疗骨质疏松症的疗效明确，且对于一些基本的机制研究亦取得一定进展，但仍存在一定的局限性，尚需结合现代最新研究方法和技术对其机制进行更全面更深入的探索。

益气活血方对慢性心力衰竭大鼠心室重构的干预作用及其机制

目的:观察益气活血方对慢性心力衰竭模型大鼠心脏结构变化的影响,并从线粒体动力学和分泌型糖蛋白(Wnt)/β-链蛋白(β-catenin)通路探讨其作用机制。方法:40只雄性SD大鼠随机选取10只为假手术组,其余行左冠状动脉前降支结扎术构建慢性心力衰竭(CHF)大鼠模型,造模完成后随机分为模型组、卡托普利组和益气活血组,每组10只。给药组分别予以卡托普利片13.5 mg·kg^-1·d^-1,益气活血颗粒20 g·kg^-1·d^-1灌胃给药,干预8周后取心脏组织,称取体质量与心脏质量结合超声心动图检测心脏结构变化情况,行马松(Masson)染色测定心肌间质胶原容积分数,应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌线粒体融合蛋白视神经萎缩相关蛋白1(Opa1),分裂蛋白线粒体动力相关蛋白1(Drp1)的表达水平,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测Wnt/β-catenin通路相关因子低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6),糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β),β-catenin mRNA的表达。结果:与假手术组比较,模型组左心室壁明显增厚(P<0.05),心腔明显扩大、心肌间质胶原含量升高(P<0.01);Opal表达水平降低,Drp1表达水平升高(P<0.01),LRP6,GSK-3β,β-catenin的mRNA表达量升高(P<0.01)。与模型组比较,益气活血组可减轻室壁增厚和心腔扩大(P<0.05,P<0.01),降低心肌间质胶原含量(P<0.05);上调Opa1的低表达、下调Drpl的高表达、下调LRP6,GSK-3β,β-catenin的高表达(P<0.01),作用效果优于或不劣于卡托普利组。结论:益气活血方可有效减轻慢性心力衰竭大鼠心室重构、改善线粒体能量代谢,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin的相关因子的表达相关。