珠子参β-香树素合成酶基因的克隆和生物信息学分析

β-香树素合成酶(beta-amyrin synthaseβAS)是定向分流齐墩果烷型皂苷和达玛烷型皂苷的限速酶,对药用植物三萜皂苷的生物合成具有重要的调控作用。基于珠子参转录组数据中βAS转录本序列设计引物,利用RT-PCR方法从珠子参根状茎中克隆得到βAS基因全长c DNA序列,命名为pjβAS。经测序鉴定该基因长度为2 655 bp,包含一个2 286 bp的完整开放阅读框,编码761个氨基酸,在Gen Bank数据库的登录号为KX254566。生物信息学分析显示,其编码蛋白分子量为87.90 k D,理论等电点(p I)5.84,不含跨膜区,为非分泌蛋白,含有38处磷酸化位点,主要于叶绿体和内质网中发挥生理作用;二级结构预测发现其α-螺旋占39.82%、延伸链16.56%、β-转角10.38%、无规则卷曲33.24%,具有DCTAE、QW(QXXXXXW)和MWCRCY3个氧化鲨烯环化酶(OCS)基因家族特征保守基序;pjβAS蛋白与竹节参(AKN23431.1)序列的一致性为100%,系统进化分析中与竹节参(AKN23431.1)、西洋参(AGG09939.1)、柴胡(ABY90140.2)划为同一分支。通过实时荧光定量PCR分析pjβAS在珠子参不同组织中的相对表达量,发现pjβAS基因在花、叶、茎、根状茎中均有表达,在叶中表达量最高,根状茎中表达量最低。

人参β-香树素合成酶同源模建及高通量虚拟筛选抑制剂的研究

人参β-香树素合成酶(β-AS)能催化氧鲨烯环化生成齐墩果烷型皂苷,从而减少植物固醇的生成量,有助于获得高效的人参皂苷.因β-AS的三维结构是未知的,我们以氧鲨烯环化酶为模板,对β-AS进行三维结构搭建.以抑制剂10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene为先导化合物,通过AutoDockvina进行分子对接,选取结合能量最低的新化合物进行研究.研究结果表明:新抑制剂8442257比先导化合物10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene的抑制效果更好.Leu287与新抑制剂结合时能量最低,是重要的残基位点;Ser413和Trp613通过氢键与新抑制剂结合,在抑制过程中起重要作用.我们的研究结果为人参β-香树素合成酶抑制剂的研究提供一个有利的依据.

竹节参β-香树素合成酶基因克隆及生物信息学分析

目的克隆三萜皂苷代谢关键酶竹节参β-香树素合成酶(β-AS)基因,采用生物信息学分析其序列及其结构与功能,为竹节参合成及调控机制研究提供基础。方法提取竹节参叶片RNA,扩增β-AS基因编码区序列,将序列连接至pMDTM18-T载体进行克隆、测序,并利用生物信息学分析比较移栽品和栽培品竹节参β-AS蛋白的特征,构建竹节参β-AS蛋白的系统进化树。结果克隆出移栽品和栽培品竹节参的β-AS基因编码区序列,开放阅读框(ORF)均为2 286 bp,编码761个氨基酸。2个品种β-AS蛋白在细胞中的基本结构和功能是一致的,但两者之间存在8个氨基酸差异,使两者的蛋白质二级结构、三级结构磷酸化位点以及理化性质存在差异,可能会导致两者的催化活性存在差异。结论克隆得到野生移栽品和栽培品竹节参的β-AS基因,并对2个品种β-AS蛋白进行了生物信息学分析和比较,为今后研究该酶的结构特征、功能以及其与皂苷含量的相关性提供参考,也为竹节参合成生物学研究提供了生物基因元件。

佛手瓜β-香树素合成酶基因表达及齐墩果烷型皂苷的分析

佛手瓜为贵州省9个优势蔬菜单品之一,含有齐墩果烷型皂苷。β-香树素合成酶(β-AS)是2,3-氧化角鲨烯物质转化成齐墩果烷型皂苷关键酶。本研究利用转录组数据并克隆获得了1条完整的佛手瓜β-AS基因(GenBank登录号MW123089),该基因开放阅读框长度为2370 bp,可编码氨基酸长度为789 aa。进化分析表明,佛手瓜β-AS与葫芦科植物处在一个分枝,但存在一定的距离。基因表达结果表明,β-AS基因在佛手瓜嫩果中表达最高,而在成熟的老果中表达量相对较低。利用LC-MS非靶向代谢组学研究发现了佛手瓜中有6种齐墩果烷型皂苷,总含量在小果(5.175 mg·100 g^(−1))和嫩果(4.811 mg·100 g^(−1))中较高。

抑制齐墩果烷型人参皂苷合成支路对达玛烷型人参皂苷生产能力的影响

表达反义βAS的5个人参发根系在液体培养条件下生长30天后,齐墩果烷型人参皂苷R0含量比对照实验组均有所降低,幅度分别达13%～40%;达玛烷型人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1含量在5个发根系中均有所增加,其中发根系A19的上述单体皂苷含量总和比对照实验组提高了30%;培养过程中达玛烷型人参皂苷含量呈逐渐增加趋势。5个发根系的βAS酶活性比对照实验组均有所下降,最多下降30%,DAS酶活性被上调,尤其发根系A19的酶活性比对照实验组提高了20%;化学分析结果显示,5个发根系人参皂苷前体物2,3-氧化角鲨烯的含量比对照实验组均有所提高。

人参β-AS基因RNAi表达载体工程菌的构建

利用重组PCR和酶切连接技术构建了人参β-香树素合成酶(β-AS)基因RNAi(RNAinterference,RNAi)植物表达载体,再经热转化法转化到发根农杆菌A4菌株中,得到含有人参β-AS基因RNAi植物表达载体的工程菌,为诱导转化人参外植体奠定了基础。

油茶氧化鲨烯环化酶基因序列分析

氧化鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)是甾醇和三萜合成的关键酶之一。以油茶(Camellia oleifera)未成熟种仁为材料进行转录组分析,并鉴定出4个OSC基因,分别命名为CoOSC1/CoCAS、CoOSC2/CobAS、CoOSC3/CoLAS及CoOSC4/CoaAS,CoOSC1和CoOSC2为全长序列。OSC系统进化树表明,CoOSC1为环阿屯醇合成酶、CoOSC2为β-香树素合成酶、CoOSC3为羊毛甾醇合成酶、CoOSC4为α-香树素合成酶。

川续断皂苷合成路径关键基因的挖掘与生物信息学分析

川续断有滋补肝肾、强健筋骨、续接折伤、止崩漏的作用,主要有效成分为齐墩果烷型的三萜皂苷。为了探究川续断三萜皂苷生物合成途径及其关键酶的功能,本研究利用转录组测序对川续断三萜皂苷合成路径中的关键酶基因进行挖掘,并对相应核苷酸序列、氨基酸序列以及蛋白质结构特征等进行生物信息学分析。结果获得了鲨烯环氧酶3条候选基因、β-香树素合成酶1条候选基因、催化合成齐墩果酸的细胞色素氧化酶P4506条候选基因、催化合成常春藤皂苷元的细胞色素氧化酶P4508条候选基因以及催化合成崴岩仙皂苷A的糖基转移酶12条候选基因。本研究结果为川续断三萜皂苷合成通路的完全解析、川续断皂苷的生物合成以及川续断遗传改良和分子育种提供分子依据。