薄层扫描法测定不同产地黑骨藤中β-香树酯醇

采用薄层扫描法测定黑骨藤药材中β-香树酯醇,并评价不同产地黑骨藤药材的质量。方法中以石油醚-氯仿（1＋1.5）二元溶剂体系为展开剂,在硅胶薄层板上分离得清晰斑点,然后在536 nm波长处采用单波长线性透射扫描斑点。β-香树酯醇的质量在0.39~3.51μg范围内与其峰面积呈线性关系。在0.978,1.220,1.464μg 3个添加水平下β-香树酯醇的平均回收率分别为101.3%,96.8%,100.2%。

甘草β-香树酯醇合成酶的多态性对其催化效率的影响研究

目的:分析与高、低甘草酸含量密切相关的β-AS(A-T)基因型和β-AS(G-C)基因型在酿酒酵母中异源表达的情况,比较这2种基因型对所生成的β-香树酯醇产量的影响,从而为甘草分子育种奠定基础。方法:将克隆的甘草β-AS基因亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pY26中,从大肠杆菌中筛选出含有目的基因的重组质粒PY-β-AS,用醋酸锂法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScI中,经半乳糖诱导后,收集菌体,用气相色谱/质谱(GC-MS)分析生成的β-香树酯醇的量。结果:甘草β-AS基因所编码的酶能催化酵母内源性2,3-氧化鲨稀生成β-香树酯醇,GC-MS分析显示甘草β-AS(A-T)基因型和β-AS(G-C)基因型所生成的β-香树酯醇的质量分数分别为19.08%,1.40%。结论:甘草β-AS(A-T)基因型的催化效率高于β-AS(G-C)基因型,可为甘草分子育种奠定基础。

甘草β-香树酯醇合成酶编码区SNP与甘草酸含量的相关性研究

目的:探讨甘草β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)编码区SNP与甘草酸含量之间的相关性。方法:采用HPLC法测量80株人工栽培甘草的甘草酸含量,采用SAS 9.0软件将80株甘草按照甘草酸含量极显著水平(P<0.000 1)进行分组;采用RT-PCR技术,扩增出甘草bAS编码区序列,运用DNAman分析软件找出该序列的SNP位点,进而分析该位点与甘草酸含量高低的相关性。结果:bAS基因编码区共有94,254 bp 2个突变位点,在94 bp位点发生G/A转换,为错义突变,导致该位点处甘氨酸/天冬氨酸转换,254 bp处发生C/T转换,为同义突变,根据序列变异将所测样品划分成G-T基因型、A-T基因型、G-C基因型和A/G-C基因型。结论:A-T基因型、G/A-C基因型和G-T基因型和高含量甘草酸形成具有显著的相关性。

甘草β-香树酯醇合成酶的编码区克隆与序列分析

目的:对甘草β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)编码区进行克隆及序列分析。方法:根据已报道的光果甘草bAS基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术,以甘草主根总RNA为模板扩增出甘草bAS基因的编码区序列。结果:序列分析表明,所克隆的bAS基因编码区长为2 289 bp,编码762个氨基酸残基,命名为GubAS(GenBank注册号:FJ627179),推测的氨基酸序列与光果甘草、光叶百脉根、豌豆、截形苜蓿、大豆的氨基酸序列同源性最高,分别达99%,92%,90%,90%,89%。结论:首次报道了甘草bAS基因的编码区序列,为进一步研究三萜类化合物的生物合成机制及为甘草优良品种的选育奠定基础。

刺五加β-香树酯醇合成酶基因的克隆及其表达与皂苷量的相关性

目的克隆刺五加的β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因,并分析其表达对皂苷量的影响。方法利用同源克隆法克隆刺五加的bAS基因。利用Real time PCR技术,分析刺五加bAS基因的表达规律,分光光度法测定总皂苷量。结果克隆到cDNA长度分别为1223、1226 bp的刺五加bAS1、bAS2基因。bAS1和bAS2基因在各时期和器官中均有表达,但表达量差异显著(P<0.05)。bAS1基因在萌芽期的表达量最高,之后迅速降低,并基本维持恒定。在整个生长期中bAS2表现出低→高→低的表达特点。bAS1基因在各器官中的表达量基本恒定,bAS2基因在叶片中的表达量最高。茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,bAS1基因的表达未发生显著变化,bAS2的表达量显著上升。刺五加的皂苷量与bAS2呈极显著的正相关关系(P<0.01),bAS1基因未达显著水平。结论 bAS2可能是催化刺五加三萜皂苷生物合成的关键酶。

黑骨藤药材薄层色谱检测方法研究

目的建立黑骨藤药材的薄层色谱鉴别方法。方法:黒骨藤经不同方法提取后,分别以:1)石油醚-三氯甲烷(1∶1.5);2)三氯甲烷-甲醇(25∶1)为展开剂,对黒骨藤中β-香树酯醇乙酸酯,β-香树酯醇,滇杠柳苷元A,27-羟基-α-香树酯醇进行薄层鉴别。结果:薄层色谱鉴别斑点清晰,能有效鉴别黒骨藤中β-香树酯醇乙酸酯,β-香树酯醇,27-羟基-α-香树酯醇,滇杠柳苷元A。

陆英化学成分的研究(Ⅰ)

从忍冬科植物陆英SambucuschineseLindl 分离鉴定了 3β 香树酯醇乙酸酯 (Ⅰ )和咖啡酸乙酯 (Ⅱ ) 。

基于关键酶靶点基因研究内生青霉P116-1a提高刺五加皂苷含量的机制

为了探明刺五加鲨烯合酶(squalene synthase,SS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)和β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因家族各成员中靶点基因在内生青霉P116-1a提高皂苷含量的作用机制,我们利用Real time PCR法检测了回接P116-1a对刺五加SS、SE和β-AS基因家族各成员表达的影响;应用分光光度法测定总皂苷含量变化,并以SPPS17.0软件进行相关性分析。结果表明,回接菌株P116-1a后,SS1的表达量显著降低(p<0.05),SS2呈先高后低的变化趋势。SE1的表达量显著提高(p<0.05)。回接的早期,P116-1a显著抑制了SE2的表达(pAS2<0.05),之后回复正常。β-AS1呈现先高后低的变化趋势与SS1的变化趋势相似;β-基因的表达量显著提高(p<0.05)。菌株P116-1a显著提高了刺五加的皂苷含量(p<0.05)。SS2、SE1和β-AS2的表达量变化与刺五加的皂苷含量变化呈显著的正相关关系。我们初步判断,SS2、SE1和β-AS2是P116-1a提高刺五加皂苷含量的作用靶点基因。

太空环境对甘草中甘草酸生物合成相关基因的诱变作用分析

目的:探讨太空环境对甘草酸相关基因的诱变作用分析。方法:利用返回式卫星搭载甘草,18 d后返回地球,搭载种子返回地面后与对照组同时种植于实验田中,采集三年生甘草叶子,对甘草酸形成相关基因ITS序列,β-香树酯醇合成酶基因的多态性以及基因表达差异进行了研究。结果:甘草经过卫星搭载后,甘草酸相关基因ITS序列没有发生变化,而甘草酸合成关键基因β-香树酯醇合成酶基因某些位点呈现了差异性,并且太空环境对甘草酸合成关键基因β-香树酯醇合成酶基因表达有一定影响。结论:太空环境对甘草酸相关形成和表达产生一定影响,这些变化对于揭示太空环境对甘草酸形成的基因机制具有重要意义,并且对于后期选育甘草优良种质奠定基础。