玫瑰β-1,3-葡聚糖合成酶基因(RrCalS)克隆与生物信息学分析

为了探明胼胝质对玫瑰授粉亲和性的影响,本研究以‘唐红’玫瑰花柱为试材,采用RT-PCR和RACE方法获得了玫瑰β-1,3-葡聚糖合成酶基因的cDNA全长,命名为RrCalS。该基因全长5742 bp,开放阅读框5295 bp,编码1764个氨基酸。推导编码蛋白的分子量为204.7kD, PI值为9.00,在164-265位具有pfam14288结构域,在869-1642位具有pfam02364保守结构域,属于葡聚糖合成酶超家族;该蛋白属于疏水性、非分泌型蛋白,具有16个跨膜结构域,含有32个Ser磷酸化位点、21个Thr磷酸化位点、12个Tyr磷酸化位点;该蛋白的α-螺旋占49.49%,无规则卷曲占22.68%,β-转角占7.94%;该蛋白与Fragaria vesca等8种植物的Cals氨基酸序列同源性达73%以上,且它们的系统进化关系与传统分类结果一致。本研究为进一步深入研究玫瑰授粉不亲和机理,提高玫瑰育种理论和技术水平奠定了基础。

禾谷镰孢菌β-1,3-葡聚糖合成酶催化亚基GLS2异源表达体系的建立

本研究旨在利用草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda昆虫细胞Sf9-杆状病毒表达系统筛选禾谷镰孢菌Fusarium graminearum β-1,3-葡聚糖合成酶催化亚基GLS2在昆虫细胞中的异源表达载体和分离纯化所用的去污剂,为后续研究该蛋白与药剂的结合模型提供基础。通过对杆状病毒表达质粒pFastBac进行设计和改造、利用同源重组的方法构建质粒、使用昆虫细胞表达系统对重组蛋白进行异源表达、筛选适合提取目的蛋白的去污剂等方法,得到适合禾谷镰孢菌β-1,3-葡聚糖合成酶催化亚基GLS2异源表达的载体和分离目的蛋白的方法。结果表明,载体pFastBac-GP67-8×His-GFP-TEV-FgGLS2、pFastBac-HA-8×His-GFP-TEV-FgGLS2、pFastBacGP67-6×His-2×Strep-TEV-FgGLS2和pFastBac-FgRHO-TEV-8×His均可在草地贪夜蛾昆虫细胞Sf9表达系统中进行表达,其中:GP67-8×His-GFP-TEV-FgGLS2融合蛋白可以用去污剂十二烷基二甲胺氧化胺(dodecyldimethylamine oxide,DDAO)从细胞膜上分离,HA-8×His-GFPTEV-FgGLS2融合蛋白可以用去污剂十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-dodecyl-β-maltoside, DDM)、十烷基-β-D-麦芽糖苷(n-decyl-β-maltoside, DM)或DDAO从细胞膜上分离,GP67-6×His-2×Strep-TEV-FgGLS2融合蛋白可以用去污剂DM或DDAO从细胞膜上分离。本研究首次成功地在草地贪夜蛾昆虫细胞Sf9表达系统中表达了β-1,3-葡聚糖合成酶催化亚基GLS2,FgRHO蛋白可促进FgGLS2的稳定表达,并筛选到适合FgGLS2提取的去污剂DDAO。

哒嗪酮类(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶抑制剂的三维定量构效关系研究

为了探讨哒嗪酮类(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶抑制剂的结构与其药理活性的相互关系,本次研究拟对20个哒嗪酮类化合物分别利用比较分子力场分析法(CoMFA)和比较分子相似性指数分析法(CoMSIA)进行三维定量构效关系(3D-QSAR)的研究,并各自建立起相应的模型.通过对计算结果进行分析发现:利用CoMFA建立起来的模型相关系数r^2=0.999,交叉验证系数q^2=0.585;而CoMSIA模型的相关系数r^2=0.987,交叉验证系数q^2=0.534,均满足标准模型的需要.而将这2种方法建立起来的3D-QSAR模型用于哒嗪酮类化合物的抗真菌活性的预测,也均表现出良好的效果.并且从等值面图的分析可以看出,在哒嗪酮类(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶抑制剂的结构上适当引入一些疏水基团和氢键受体可以增强该类化合物的抗真菌活性.

去氢木香内酯特异性抑制Saccharomyces cerevisiae细胞壁中β-葡聚糖的合成

基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其细胞壁合成酶缺陷突变株组成的靶标定向全细胞筛选模型,对去氢木香内酯抗真菌的作用机制进行研究,发现去氢木香内酯特异性抑制β-葡聚糖合酶基因缺陷突变株Δfks1,其最低抑制浓度MIC值为16μg/mL,比野生型WHU2a和几丁质合酶基因缺陷突变株均低2倍;其对WHU2a生长的抑制能被山梨醇等渗溶液部分挽救;IC20浓度的去氢木香内酯处理后WHU2a的β-葡聚糖含量降低了16.83%,512μg/mL去氢木香内酯抑制了26.66%的β-葡聚糖合酶活性。研究结果表明,去氢木香内酯能特异性抑制真菌细胞壁中葡聚糖的合成,从而抑制真菌细胞生长。

(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶小分子抑制剂研究进展

(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶抑制剂通过破坏真菌细胞壁的合成而产生特异性的抗真菌作用。目前上市的(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶抑制剂均为环六脂肽类,只能通过静脉注射给药。研发合成简便、可口服的(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶小分子抑制剂具有巨大的研究前景。本文综述了近年来葡聚糖合成酶小分子抑制剂的研究进展。

抗真菌药物研究进展

本文概述了抗真菌药物的现状和近年来剂型、结构改造和筛选等方面的研究进展,着重介绍了-β1,3-D-葡聚糖合成酶抑制剂和抗真菌靶位的新进展,并对抗真菌药物研究开发中存在的问题和发展方向进行了探讨。

微生物来源的抗真菌抗生素研究进展

新的微生物来源的抗真菌抗生素不断涌现。本文就近 2年来研究及开发或进行临床试验的化合物 ,依据它们作用的靶向部位不同 ,按真菌细胞膜、细胞壁以及蛋白质合成

微生物来源的抗真菌药物

近几年来 ,新的微生物来源的抗真菌药物不断涌现。一些抗真菌抗生素经过制剂加工后 ,毒性显著降低 ,而一些新化合物则有较强的抗真菌活性。依据其作用靶向部位的不同 ,微生物来源的抗真菌药物可分为三类 :真菌细胞膜抑制剂、细胞壁抑制剂以及蛋白质合成抑制剂。

地锦草提取物对红色毛癣菌酶活性的影响

目的研究地锦草提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的影响,探讨其抗真菌作用机制。方法药物干预红色毛癣菌后分离菌体,按试剂盒要求处理样品,利用酶联免疫法和荧光分光光度法,研究地锦草提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性的作用。结果地锦草提取物256μg.m l-1时,可显著降低红色毛癣菌中角鲨烯环氧化酶的活性(P<0.01);不同浓度的地锦草提取物,均可降低红色毛癣菌β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性(P<0.01)。结论地锦草提取物抗真菌机制可能与抑制角鲨烯环氧化酶和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性有关。

香鳞毛蕨提取物对红色毛癣菌的抑制作用研究

目的:研究香鳞毛蕨醇提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的抑制作用,初步探讨其抗真菌作用机制。方法采用 ELISA测定角鲨烯环氧化酶活性,还原糖法测定β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性。结果香鳞毛蕨提取物不同浓度组均能降低红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性,差异有统计学意义(P<0.05),随香鳞毛蕨提取物浓度增加,红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性逐渐降低,香鳞毛蕨提取物中浓度组和高浓度组能降低β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性,差异有统计学意义(P=0.002,P=0.000)。结论香鳞毛蕨提取物抗真菌作用机制可能和角鲨烯环氧化酶和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性受到抑制有关。

灵芝细胞中异源表达透明颤菌血红蛋白基因提高胞外多糖的产量

在灵芝(Ganoderma lingzhi)中异源表达透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)基因,采用一氧化碳差异波谱分析的方法检测转基因菌株的生物活性,并对野生型菌株和工程菌株进行发酵,通过荧光定量PCR对灵芝多糖生物合成途径上的葡萄糖磷酸变位酶(α-phosphoglucomutase,PGM)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate glucose pyrophosphorylase,UGP)和β-1,3-葡聚糖合酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)3个基因的转录水平进行分析。研究表明:透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)在灵芝中能够成功表达,并且具有生物活性;工程菌株中胞外多糖的最高产量达0.83g/L,比野生型菌株提高了88.6%;与野生型菌株相比,工程菌株中多糖生物合成途径上PGM、UGP和GLS基因的相对表达量分别是1.52、1.55和3.85。异源表达透明颤菌血红蛋白基因是提高灵芝胞外多糖产量的一种有效方法。