黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。

拟青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶同源建模及共价固定化

采用同源建模的方法构建拟青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶的三维结构。通过对其活性位点及表面氨基酸残基侧链的分析,利用氨基载体Sepabeads EC-HA共价固定化葡聚糖酶,优化固定化条件,比较固定化酶与游离酶的酶学参数。结果表明:m(酶粉):m(载体)=1.2:1、温度40～45℃、固定化时间8h,固定化效果最好。蛋白结合率可达91.7%,酶活回收率达87.6%,固定化酶最适温度、热稳定性、pH值稳定性和批次使用稳定性均得到明显提高。

微波促进的1,3-偶极环加成4β-1,2,3-三唑鬼臼毒素的合成

在微波作用的无溶剂条件下 ,由 4β 叠鬼臼毒素与炔烃反应 ,合成了 8个含有 1,2 ,3 三唑的鬼臼毒素衍生物 ,并用IR ,1HNMR ,MS确定了这些化合物的结构 .该反应操作简单 ,产率较高 ,副产物少 ,同时具有原子经济性 .

源于Paecilomyces sp.FLH30内切β-1,3(4)葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

【目的】β-1，3（4）-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，广泛地应用于饲料业、酿造业及纺织业。【方法】以来源于Paecilomyces sp．FLH30的葡聚糖酶基因为研究对象。据毕赤酵母GS115对密码子的简并性和偏爱性，对来源于淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）β-1，3（4）-葡聚糖酶基因进行了优化，通过全基因技术合成了全长基因GLUnm并构建重组酵母表达载体pPIC9K—GLUnm，用SacI线性化重组质粒pPIC9K—GLUnm，电击转化至毕赤酵母GS115中进行表达。【结果】通过表型筛选，遗传霉素抗性筛选，经PCR鉴定表明，葡聚糖酶基因整合至酵母染色体DNA中。在试管中经甲醇诱导表达，并测定葡聚糖酶酶活性。在试管水平表达的酶活性是0．68IU／mL，即可以认为在摇瓶表达水平的初始酶活性为0．68IU／mL，将此菌株在摇瓶水平表达，酶活性在表达84h为最高，是11．26IU／mL。【结论】重组β-1，3（4）-葡聚糖酶的最适pH为5．0，最适反应温度为50℃，在pH5．0～8．0，温度37—50℃的条件下较稳定。

一锅法合成4-[4,6-二(2,4-二甲苯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-1,3-苯二醇

以三聚氯氰为起始原料,与间二甲苯和间苯二酚在氯化铝和浓盐酸的催化作用下经两次傅克反应一锅法合成了4-[4,6-二(2,4-二甲苯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-1,3-苯二醇,产物结构经^(1)H NMR、^(13)C NMR和ESI-MS进行了确证。采用单因素实验考察了催化剂种类、助催化剂用量、反应温度和反应时间对该反应的影响。实验结果表明,较佳的反应条件为:以氯化铝为催化剂,浓盐酸用量为氯化铝质量的6%、第一步反应温度为5℃,第二步反应温度为80℃,4-[4,6-二(2,4-二甲苯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-1,3-苯二醇的收率可达91.5%,纯度为99.3%。

催化邻羟基苯基取代对亚甲基醌与酮亚胺环加成反应合成二氢-1,3-苯并噁嗪化合物

发展了邻羟基苯基取代对亚甲基醌与酮亚胺在磷酸催化体系中的[4+2]环加成反应,以高产率和优良的非对映选择性得到了一系列二氢-1,3-苯并噁嗪化合物.当向反应体系加入催化量的B(C_(6)F_(5))_(3)时,产物的产率得到保持且发生非对映选择性翻转.

手性毛细管气相色谱法拆分4-氯甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环对映异构体

手性化合物具有独特的生物活性,其在药物治疗中发挥着关键作用。为准确测定对映异构体中不同构型的纯度,建立手性化合物对映体分离方法十分关键。4-氯甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环是一种重要的手性医药中间体,本文建立了一种手性毛细管气相色谱拆分测定4-氯甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环对映异构体的方法。采用固定相为环糊精衍生物的色谱柱Rt-bDEXse进行分离,并以氢火焰离子化检测器进行检测。经过优化,得到最优色谱条件:线速度为70 cm/s;升温程序为初始柱温70℃保持1 min,以2.0℃/min的速率升温到150℃;溶样溶剂为甲醇。实验结果表明,在该条件下,(R)-4-氯甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环和(S)-4-氯甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环可在10 min内快速分离,两者的分离度远大于1.5,在0.5~50.0 mg/L的范围内线性关系良好,线性相关系数均大于0.998,(R)-和(S)-4-氯甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环的检出限分别为0.07和0.08 mg/L,定量限分别为0.22 mg/L和0.25 mg/L。以甲醇作为空白样品,进行0.5、2.0、10.0 mg/L 3个不同水平的加标回收试验,(R)-和(S)-4-氯甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环的回收率分别为94.0%~99.1%和96.0%~98.8%,相对标准偏差(RSD)分别为1.26%~4.87%和1.51%~4.46%。该方法可为手性医药中间体4-氯甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环对映异构体的拆分提供参考。

2,2-二甲基-4-羟基-1,3-苯并二噁茂的合成研究

以2-甲氧基丙烯代替2,2-二甲氧基丙烷为原料合成了2,2-二甲基-4-羟基-1,3-苯并二噁茂。研究了影响反应收率的因素,优化条件为:以二甲苯为溶剂,m(焦性没食子酸)∶m(二甲苯)=1.0∶5.0,n(焦性没食子酸)∶n(2-甲氧基丙烯)=1.00∶1.20,2-甲氧基丙烯滴加温度135℃,滴加时间6 h。优化条件下产物纯度99.2%,收率88.5%,其结构经GC-MS、^(1)H NMR确认。该工艺转化率高、收率高、“三废”少,具有工业化应用前景。

拟青霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶基因克隆、表达及重组酶性质

采用改造的酿酒酵母表达载体pYES2-GSL构建了拟青霉Paecilomyces sp.FLH30表达cDNA文库,刚果红平板法筛到一内切β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(PsBg16A),全长cDNA为1 217 bp,完整开放阅读框(ORF)951 bp,编码316个氨基酸,属于糖苷水解酶16家族。去信号肽的PsBg16A克隆入表达载体pET28a(+)并在E.coli BL21成功表达,经16°C 20%乳糖诱导24 h,酶活达482 U/mL。重组PsBg16A可水解大麦葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖,显示PsBg16A为典型的β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6),重组酶最适pH和温度分别为7.0和65°C,对大麦葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖的Km分别为3.12、4.86和10.32 g/L。

2-[5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1,3,4-噻二唑-2-基硫代]-1-(2,3,4-三甲氧基)苯乙酮肟醚合成与抗烟草花叶病毒活性研究

合成了4个2-[5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1,3,4-噻二唑-2-基硫代]-1-(2,3,4-三甲氧)苯乙酮肟醚新化合物,并经过元素分析、红外光谱、核磁共振氢谱对其结构进行了表征.初步生物活性测试表明,化合物具有一定抗烟草花叶病毒活性.

噁唑、苯并噁唑及1，3，4-噁二唑硫醚的合成及抗肿瘤活性研究

设计并以噁唑、苯并噁唑及1,3,4-噁二唑硫醇与卤代烃反应合成了14个硫醚类杂环化合物,其中13个化合物未见文献报道.目标化合物的结构均通过1H NMR谱、MS和元素分析进行了表征.采用MTT[3-(4,5-dimethylthiagol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrogolium bromide]法对14个目标化合物进行了体外抗肿瘤活性测定,结果表明:在10-5mol/L浓度下,10个化合物对肿瘤细胞具有抑制活性.

沙质微泡菌β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质

【背景】β-葡聚糖是自然界中广泛存在的非淀粉多糖,是谷类植物细胞壁的主要成分。β-葡聚糖酶能够水解β-葡聚糖生成低聚合度的寡糖,在食品、饲料、造纸等领域发挥着重要的作用。【目的】从海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)中克隆到一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,在大肠杆菌中可溶表达,研究其相关酶学性质。【方法】以沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)基因组DNA为模板,克隆一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(MaGlu16A),构建重组表达载体p ET-28a-MaGlu16A并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行酶学性质研究。【结果】MaGlu16A的最适pH和最适温度分别为pH 6.0和40°C,在pH 5.0-10.5和35°C以下稳定。对EDTA具有较高的抵抗性,在1 mmol/L和10 mmol/L EDTA浓度下仍保持99.3%和82.5%的酶活力。该酶能够有效水解可得然多糖、昆布多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖、燕麦葡聚糖和酵母葡聚糖,水解产物主要为葡萄糖、二糖、三糖和四糖。【结论】海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbiferarenaceous)来源β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质的测定为β-葡聚糖酶的挖掘及β-葡寡糖的制备奠定了基础。

1,3-二甲基-5-甲硫基-4-苯腙基羰基吡唑的合成及抑菌活性

Eight derivatives of 1,3-dimethyl-5-methylthio-4-phenylhydrazonocarboxyl pyrazole were synthesized from 1,3-dimethyl-5-methylthio-4-hydrazinocarboxyl pyrazole. All compounds synthesized were identified by 1H NMR and elemental analysis. Some of them exhibited certain growth inhibition action to Phoma asparagi, Alternaria solani, Gibberella zeae, Physalospora piricola, Colletotrichum lagenarium as tested in vitro at dosage of 50 mg/L.

1,3-双(4-氨基-2-三氟甲基苯氧基)苯及其无色透明聚酰亚胺薄膜的制备与性能研究

以间苯二酚和2-氯-5-硝基三氟甲苯为基本原料,在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中,经亲核取代反应制得1,3-双(4-硝基-2-三氟甲基苯氧基)苯(DNRes-2TF),并利用Pd/C、水合肼进一步还原得到1,3-双(4-氨基-2-三氟甲基苯氧基)苯(DARes-2TF)。随后,以该二胺和芳香族二酐在N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)溶剂中,聚合得到聚酰胺酸溶液,热亚胺化得到无色透明聚酰亚胺薄膜,并对薄膜性能进行了研究。结果表明:含氟取代基及间位取代结构是制备无色透明聚酰亚胺的一条颇具前途的路线,且不会牺牲材料的耐热稳定性及力学性能。

2-(2-喹啉偶氮)-4-甲基-1,3-苯二酚光度法测定铜的研究

合成了新试剂 2 - (2 -喹啉偶氮 ) - 4-甲基 - 1,3-苯二酚 (QAMDHB) ,并研究了其与铜的显色反应 ,在 p H=2 .2的磷酸 -磷酸二氢钾缓冲介质中 ,溴化十六烷基三甲基胺 (CTMAB)存在下 ,QAMDHB与铜反应生成 2∶ 1稳定络合物 ,λmax=5 5 0 nm,ε=4 .84× 10 4L· mol-1· cm-1。铜含量在 0— 2 0μg/ 2 5 m L范围内符合比耳定律 ,方法用于环境水样中铜含量的测定 。

新显色剂4-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-1,3-二氨基苯的合成及其与钯显色反应的研究

合成并用红外光谱和元素分析鉴定了吡啶偶氮氨类试剂：4-（5-硝基-2-吡啶偶氮）-1,3-二氨基苯（5-NO2-PADAB）,研究了该试剂与钯的显色反应。在0.36-2.04 mol/L HClO4介质中,钯与试剂形成1∶1的蓝色配合物,其最大吸收波长位于586 nm处。表观摩尔吸光系数为1.04×10^5L.mol-1.cm^-1,钯的质量浓度在0-1.2μg/mL范围内符合比尔定律。方法是目前测定钯的高灵敏和高选择性体系之一。

1,3-双(4-氨基苯氧基)苯的合成及其聚酰亚胺

间苯二酚和对氯硝基苯通过缩合反应,合成得到了1,3-双(4-硝基苯氧基)苯(134BNPB);随后,在Pd/C-水合肼的还原体系中,被进一步还原,得到了1,3-双(4-氨基苯氧基)苯(134BAPB)单体。基于134BAPB单体,制得了多种结构的芳香族聚酰胺酸树脂及其对应的可溶性聚酰亚胺树脂,并对它们的性能进行了研究。

1,3-二(4-硝基苯氨基重氮)苯的合成及其与镍Ⅱ的显色反应

合成了一种新型的双三氮烯类显色剂1，3-二（4-硝基苯氨基重氮）苯，并对该试剂与Ni^＋的显色反应进行了研究。实验表明，在Triton X～100存在下，pH10．6的硼砂一氢氧化钠缓冲溶液中，该试剂与N姐）形成了3：1的红色络合物，其最大吸收波长位于480nm处，表观摩尔吸光系数ε为2．15×10^5L·mol^-1·cm^-1，Ni^2＋的质量浓度在0～0．64mg／L范围内遵守比尔定律。试剂用于分光光度测定铝合金标样中镍，测定值与认定值相符。

N-(5-巯基-1，3，4-噻二唑-2-基)-N'-取代苯甲酰基脲与取代的苯氧乙酰基脲的合成与生物活性

通过2-氨基-5-巯基-1,3,4-噻二唑与取代苯甲酰基异氰酸酯及取代苯氧乙酰基异氰酸酯反应,合成了21种新的取代苯甲酰基脲与取代苯氧乙酰基脲,其结构用红外光谱、核磁共振氢谱和元素分析进行了确证,初步的生物活性测定试验表明,部分目标化合物具有良好的植物生长调节活性.

SnCl_4催化合成2-庚基-1,3-二(口恶)戊烷

探讨了以四氯化锡为催化剂,催化合成2-庚基-1,3-二(口恶)戊烷的优化反应条件:催化剂用量为正辛醛质量的9.1%, 油浴温度为88-90℃,反应时间6h,正辛醛与乙二醇的物质的量之比为1:1.2,收率达92.7%。