油菜(Brassica napus)β-1,4-木糖基转移酶基因BnIRX14克隆、序列分析及亚细胞定位

糖基转移酶(Glycosyltransferase,GTs)广泛参与植物次生物质的代谢及生物和非生物胁迫,β-1,4-木糖基转移酶属于糖基转移酶GT43家族成员。为了探究油菜β-1,4-木糖基转移酶对油菜次生物质的代谢和逆境调控,利用5′RACE和3′RACE方法从甘蓝型油菜中扩增获得油菜β-1,4-木糖基转移酶基因BnIRX14全长cDNA,该cDNA具有1566 bp的完整开放阅读框,编码522个氨基酸,分子质量约58.92 ku,由8315个原子组成,分子式为C_(2631)H_(4168)N_(742)O_(753)S_(21),具有多个磷酸化位点和糖基化修饰位点,属非分泌性单次跨膜蛋白。结构域分析表明,BnIRX14具有GTs家族保守的DxD保守结构域和UGT糖基转移酶PSPG特征结构域,属于糖基转移酶GT43家族成员。BiFC亚细胞定位初步显示BnIRX14定位于细胞质中,蛋白互作预测表明BnIRX14与各类糖合成和转运蛋白高度互作。结构域预测和互作分析初步表明,BnIRX14属于油菜糖基转移酶GT43家族成员,可能通过与糖合成和转运相关蛋白互作参与油菜木糖的合成代谢进而参与生长发育及逆境响应。

毕赤酵母中内切β-1,4葡聚糖酶的表达及共培养制备低分子质量黄原胶

低分子质量黄原胶具有抑菌、益生及抗氧化等多种生物活性,因此通过水解制备低分子质量黄原胶具有广阔应用前景。该研究将来源于绵羊瘤胃元基因组的内切β-1,4-葡聚糖酶首次在毕赤酵母中表达,其在pH 7.0和75℃下发挥最佳作用,并有较高的pH和温度稳定性。此后,建立了毕赤酵母和野油菜黄单胞菌的共培养体系并对发酵条件进行优化,其中野油菜黄单胞菌生成的黄原胶可以被毕赤酵母分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶直接降解产生低分子质量黄原胶。摇瓶水平下,共培养体系中总糖最高为11.4 g/L,水解产物中重均分子质量为2500 Da的低分子质量黄原胶达到93.79%。该研究为功能性低分子质量黄原胶的工业化生产提供了一个潜在的策略。

三七内切-β-1,4-葡聚糖酶基因PnCel1的表达及功能分析

内切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-β-glucanases,EGases)广泛参与植物细胞壁的编辑,在组织伸长、果实成熟和脱落等过程中起重要作用。该研究采用RT-PCR方法,从三七(Panax notoginseng)中克隆了1个EGases基因(PnCel1),并对其进行表达和功能分析。结果显示:(1)外源茉莉酸甲酯、水杨酸、赤霉素、脱落酸和乙烯利处理显著诱导PnCel1的表达,而根腐病菌茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)以及交链格孢(Alternaria alternata)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)侵染三七后显著抑制PnCel1的表达。(2)亚细胞定位分析表明,PnCel1-GFP融合蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞壁中。(3)采用染色体步移技术克隆出PnCel1的启动子序列[(-1)~(-828)bp],进而成功构建PnCel1启动子驱动的β-葡萄糖醛酸酶植物表达载体(pBI121-PPnCel1-GUS)并转入烟草(Nicotiana tabacum L.),经PCR筛选鉴定获得阳性转基因烟草7株。(4)GUS活性检测结果表明,5种植物激素能诱导PnCel1的启动子活性,但茄腐镰刀菌等4种病原菌侵染明显降低了PnCel1启动子的转录活性,且PnCel1启动子受三七WRKY转录因子PnWRKY5/9/12/15/27的负调控。(5)PnCel1过表达转基因烟草与野生型烟草相比,对茄腐镰刀菌的易感性增加,木质素含量降低,表明PnCel1可能参与改变细胞壁的结构。研究表明,植物激素能上调三七根中PnCel1的表达,而病原菌侵染降低了PnCel1的表达水平,并抑制PPnCel1的活性,推测三七PnCel1可能通过改变细胞壁结构而增加三七对根腐病菌的易感性。

桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶活性分析及其基因CDs区的克隆与表达

【目的】研究陕南地区桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因,为构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。【方法】用质量分数为1%的羟甲基纤维素钠（CMC-Na）测定桑天牛幼虫内切β-1,4-葡聚糖酶活性,Trizol法提取桑天牛肠道总mRNA,扩增其内切β-1,4-葡聚糖酶基因,用DNAStar和NCBI上的BLAST进行序列分析。根据测序得到的基因序列设计1对引物,扩增桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因CDs区,构建原核表达载体pET-APEG,并在大肠杆菌中表达。【结果】桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶最适pH为4.4~5.6,pH值为5.0时酶活性最高;最适温度为30~50℃,50℃时酶活最高;酶液在37℃稳定性好,而在60℃的水浴中处理30 min,酶活性急剧下降。桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因CDs区长度为978 bp,编码325个氨基酸残基;BLAST结果显示,该基因序列与黄星天牛属于GHF5的纤维素酶基因序列相似性达85%,氨基酸序列相似性达90%,与已报道的桑天牛Ag-EaseⅢ的序列相似性达98%,氨基酸序列相似性达99%;构建原核表达载体pET-APEG在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE检测结果表明,诱导表达沉淀在约55 ku处有1条特异蛋白条带,与预测蛋白的分子量相符。【结论】陕南地区桑天牛β-1,4-葡聚糖酶为内切葡聚糖酶,属于GHF5家族,其可以在大肠杆菌中表达。

Characterization and functional analysis of β-1,3-galactosyltransferase involved in Cry1Ac resistance from Helicoverpa armigera(Hübner)

Carbohydrate chains are the principal antigens by which Bacillus thuringiensis（Bt） identify receptor proteins. The interaction between the antigen and Bt causes a pore in the membrane of midgut epithelial cells of insects. Receptor proteins, such as aminopeptidase N and alkaline phosphatase, are glycoproteins. Cadherin is another cell surface receptor protein which has potential glycosylation sites. Glycosyltransferase is very important for the synthesis and modification of receptor proteins. It can indirectly influence the function of Bt. The 1 950 bp full-length c DNA encoding β-1,3-galactosyltransferase was cloned from the the midgut of Helicoverpa armigera by degenerative PCR combined with RACE techniques（GAL-Harm, Gen Bank accession no.： GQ904195.1） with two potential N-glycosylation sites（^157NNTI^160 and ^272NKTL^275）. Protein sequence alignments revealed that H. armigera β-1,3-galactosyltransferase shared high identity with β-1,3-galactosyltransferase in other insect species. The expression level of the β-1,3-galactosyltransferase gene in Cry1Ac-resistant H. armigera larvae was 9.2-fold higher than that in susceptible strain. The function of β-1,3-galactosyltransferase was investigated using RNAi technique. The result showed Cry1 Ac enhanced the toxicity against the si RNA-treated larvae compared with non-si RNA-treated ones, which indicated β-1,3-galactosyltransferase played an important role for the insecticidal toxicity of Cry1 Ac in H. armigera.

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅱ、Ⅴ表达的亚细胞结构定位研究

目的 :研究 β1,4-半乳糖基转移酶II和V(β1,4-galactosyltransferaseⅡandⅤ ,β -1,4-GalT -ⅡandⅤ )蛋白表达的亚细胞结构定位。方法 :构建 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ融合绿色荧光蛋白 (greenfluorescenceprotein ,GFP)表达质粒 ,分别将构建的质粒转染到PC12细胞和肝癌 772 1细胞中 ,荧光显微镜下观察 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ在其中表达的亚细胞结构定位。 结果 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要表达在这两种细胞细胞核旁的高尔基复合体。结论 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要分布在高尔基复合体上 。

正、反义β-1,4半乳糖基转移酶Ⅱ和Ⅴ地高辛标记RNA探针的制备和应用

目的 :为了探讨 β1,4半乳糖基转移酶 -Ⅱ和V(β1,4-galactosyltransferaseⅠ ,β -1,4-GalT -ⅡandⅤ )表达定位 ,本实验通过分子生物学手段 ,制备了正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针。 方法 :设计引物 ,提取小鼠脑总RNA ,通过RT -PCR方法 ,得到 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ基因序列 ,将其克隆到 pGEM -T载体。根据其多克隆酶切位点和Sp6及T7位置 ,分别酶切后作为转录模板 ,通过Sp6及T7RNA聚合酶 ,得到正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和V地高辛标记的RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后 ,最后通过原位杂交分析标记探针的特异性和杂交效果。结果 :本实验得到了高效价的正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针 ,并表现出很好的杂交效果。结论 :正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和VRNA原位杂交探针的制备 ,为进一步研究 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ在组织中的表达 。

产β-1,3-1,4-葡聚糖酶特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis CGX5-1发酵培养基的优化

采用响应面优化法对一株野生特基拉芽孢杆菌的发酵培养基进行优化,最终培养基各组分为:大麦粉68.4 g/L,玉米粉40 g/L,豆饼粉61.1 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,CaCl20.1 g/L。用优化培养基在37℃摇瓶发酵52 h,β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活达到191.96 U/mL,是优化前产酶水平的1.91倍。

半合成β-1,4-葡聚糖硫酸钠的抗凝血特性(英文)

目的研究半合成-β1,4-葡聚糖硫酸钠(Na-MCS)的抗凝血效果和作用机制。方法采用凝固分析法、以肝素为阳性对照进行抗凝血效果的评价,再通过发色底物法对凝血因子进行抑制分析,揭示Na-MCS的抗凝血作用机制。结果0.6μg.mL-1Na-MCS即可显著延长APTT和TT,但在更高浓度下对PT影响仍不大,使正常人血浆的APTT延长1倍的Na-MCS剂量为0.7μg.mL-1,低于活性为150 u.mg-1的肝素。结论在一定浓度范围内,Na-MCS的抗凝血活性与肝素相当,Na-MCS通过抗凝血酶AT-III的调节作用来抑制凝血因子IIa和Xa的活性,从而产生抗凝血作用。

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究。方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化入解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中。结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌。在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1 515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5。结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达。

一株产生内切β-1,4-木聚糖酶的菌株的分离、鉴定及其酶学特性研究

内切β-1,4-木聚糖酶作为饲料添加剂可明显改善麦类的营养价值,显著提高畜禽生长速度和饲料转化率;用在纸浆漂白中可减少漂白剂的用量并提高纸张质量。利用透明圈法从长期排放食堂锅炉污水口污泥中筛选分离到一株产内切β-1,4-木聚糖酶的细菌菌株,该菌株菌体呈长杆状、革兰氏染色可变、兼性厌氧、产芽孢(次端生、孢囊膨大),鞭毛周生,命名为A3。据部分片断长度的16SrDNA序列同源性分析和生理生化试验结果,发现分离菌株与浸麻芽孢杆菌(Bacillusmacerans)最为相近。A3菌株所产内切β-1,4-木聚糖酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0～7.0,pH7.0条件下该酶在50℃下稳定,40℃条件下该酶在pH4.0～10环境中相对稳定。

细菌产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的结构、功能及应用的研究进展

细菌所产的β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)能有效降解谷物中的β-葡聚糖,但它在结构上不同于植物所产酶,它属于糖苷水解酶16家族,具有一个环状的β-三明治结构。本文将就细菌所产的β-葡聚糖酶的结构和功能进行详尽的阐述,并对酶活测定方法及其应用前景进行了探讨。关键词β-葡聚糖;β-1,3-1,4-葡聚糖酶;结构;

泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化

从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33。依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6 d。在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447 U/m L,为优化前的17.6倍。

内生芽孢杆菌BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因与定殖相关性

【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(β-1,4-endoglucanase gene,eglS),探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物,以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段,与具有单交换功能的整合载体pMUTIN-GFP+连接构建敲除质粒。eglS的过表达质粒和敲除质粒转化芽孢杆菌感受态细胞分别获得过表达突变体和敲除突变体。将过表达质粒转化敲除突变体感受态细胞获得互补突变体。采用荧光显微镜观察、PCR、平板酶活力检测及实时荧光定量PCR方法鉴定突变体。3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定突变体和野生菌的β-1,4-内切葡聚糖酶活力,同时采用定量灌根接种法检测不同菌株30 d内在小白菜各组织中的定殖数量。【结果】获得在荧光显微镜下呈现绿色荧光的过表达突变体和互补突变体。PCR检测结果表明敲除突变体中能够扩增出675 bp的目的条带,而以野生菌株和整合载体DNA为模板扩增时没有对应条带,成功得到敲除突变体。野生菌及各突变体β-1,4-内切葡聚糖酶平板活力检测结果显示,野生菌BS2只有一个水解圈且透明,过表达突变体与互补突变体有大于野生菌的双水解圈,内圈的水解圈透明,外圈的水解圈不透明。敲除突变体沿菌体边缘也有一个小水解圈。实时荧光定量PCR的分析结果证实野生菌及突变体间β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量存在差异,过表达突变体和互补突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量增高,分别是野生菌的111和82倍;敲除突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量相对于野生菌BS2几乎为0。突变体与野生菌在小白菜体内定殖数量以及酶活力检测结果表明,在相同的小白菜组织以及相同的分离时间内,敲除突变体的定殖数量最少,其在根茎叶中的定殖数量与其他菌株相比均有显著性差异(P<0.05)。敲除突变体的酶活力也显著低于其他菌株(P<0.05)。过表达突变体的酶活力以及在小白菜体内的定殖数量在P<0.05水平上显著高于敲除突变体和野生菌,互补突变体的酶活力和在小白菜体内的定殖数量与过表达突变体基本一致。【结论】内生芽孢杆菌BS2菌株β-1,4-内切葡聚糖酶的活力高低与其在小白菜体内的定殖数量之间呈正相关关系,其表达的β-1,4-内切葡聚糖酶在定殖过程中发挥一定作用。

桑粒肩天牛幼虫内切-β-1,4-葡聚糖酶的纯化及性质

经丙酮沉淀、UltrogelAcA5 4凝胶过滤、Q Sepharose离子交换柱层析和聚丙烯酰胺凝胶制备电泳 ,发现桑粒肩天牛幼虫肠液中具有所有水解纤维素成分的三种消化酶 ,并且每种酶都有不同数目的同工酶。纯化出一种内切 - β- 1 ,4 -葡聚糖酶 (EG - 1 ) ,其分子量为 2 6ku ,等电点约为pI4 0。酶的最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH为5 2 ;不耐热 ,5 0℃处理 30min ,酶活大大降低 ,70℃处理 2h ,几乎丧失全部活性 ,显示出该酶适合动物肠道反应环境 ,是内源性酶。

ERK在TNF-α诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I表达中的作用

目的研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-GalT-I)表达的调节作用。方法用不同浓度的TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并作用不同的时间,检测β-1,4-GalT-I表达变化;应用ERK通路抑制剂U0126预处理HUVECs,再用TNF-α刺激HUVECs,检测β-1,4-GalT-I的表达变化,并通过内皮-单核细胞黏附试验观察HU-VECs黏附能力的改变。结果 TNF-α诱导HUVECsβ-1,4-GalT-I表达增加,且具有剂量和时间依赖关系;U0126显著抑制TNF-α引起的HUVECsβ-1,4-GalT-I表达的上调及其黏附能力的上调。结论 ERK信号转导通路可能参与调节TNF-α诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-I的表达,并影响内皮细胞的黏附能力。

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5～6.0较稳定;最适温度为50℃,40～50℃较稳定;Cu2＋和Fe2＋对其活力有显著的抑制作用,Mg2＋、Zn2＋和Mn2＋对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。

特基拉芽孢杆菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组菌发酵培养基的优化

为了提高重组大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)(pET-28a(+)-bgl)发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的能力,研究了发酵培养基中各类碳源及氮源的影响,并通过响应面分析法优化培养基各组分的含量。结果表明,甘油为最适碳源,酵母粉及胰蛋白胨为氮源。优化的培养基组成是:yeast extract终浓度为20 g/L,胰蛋白胨12.5 g/L,甘油14.1 mL/L,KH2PO42.17 g/L,K2HPO42.74 g/L。三角瓶发酵产β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL),与初始培养基(1 671.9 U/mL)相比,提高了1.78倍。研究结果表明,发酵培养基的优化对重组大肠杆菌发酵生产工业酶具有重要作用。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析

依据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)β-1,3-1,4葡-聚糖酶基因序列,设计特异性引物,以提取的解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl),将此目的基因克隆至pTG19-T Easy载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定和克隆片段的序列测定、比较,结果表明该克隆片段扩增准确、可靠。序列比较发现,此片段与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefacines,M15674)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis,AY365256)分别有99%、95%和94%的同源性。

β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

运用选择性培养基LBCMC从环境土样中分离得到一株能利用羧甲基纤维素的芽孢杆菌Bacillus sp.NW-2004 a,并运用“鸟枪”克隆法构建了其基因组文库,且从此基因组文库中筛选得到两个阳性克隆.对其中一阳性克隆中插入的DNA片段(命名为GLUD)进行序列测定,发现了一长度为2 502 bp的开放阅读框(ORF),可编码834个氨基酸.BLAST分析结果表明,该基因与Bacillus sp.KSM-S237来源的纤维素酶基因AB018420具86%相似性,所编码的多肽与Bacillus sp.KSM-64来源的β-1,4-内切葡聚糖酶具89%的相似性,故该基因是一新发现的β-1,4-内切葡聚糖酶基因.该序列已收录于Genebank,登录号AY663839.另外,以CpoI andNotI限制性内切酶双酶切衍生于质粒pGEX的大肠杆菌表达载体pHBM625,然后将经T4 DNA polym erase处理后的β-1,4-内切葡聚糖酶基因克隆至载体pHBM625中得到重组质粒pH-BM625G lu,最后通过平板检测及SDS-PAGE凝胶电泳,均检测到该基因在大肠杆菌XL10-G lod中的表达.