微管蛋白β-2b链突变体基因真核重组表达质粒的构建及其对α微管蛋白聚合的影响

为了获得小鼠微管蛋白β-2b链突变体基因TUBB2B(N247S),并分析其对α微管蛋白聚合的影响,试验采用RT-PCR法扩增TUBB2B基因的全长cDNA序列,通过重叠延伸PCR点突变技术获得TUBB2B(N247S)突变基因,并采用分子克隆技术构建真核重组表达质粒TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10,用真核重组表达质粒转染小鼠成纤维细胞(L929细胞),并从细胞中提取α微管蛋白,采用Western-blot技术分析游离态及聚合态α微管蛋白的表达量。结果表明:通过重叠延伸PCR点突变技术成功扩增出大小为1362 bp的TUBB2B(N247S)突变基因,并成功构建出真核重组表达质粒TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10,分子质量为55 ku的突变蛋白在L929细胞中成功表达,在转染真核重组表达质粒的L929细胞中游离态α微管蛋白含量显著高于空载体转染组及空白对照组(P<0.05),而聚合态α微管蛋白含量显著低于空载体转染组及空白对照组(P<0.05)。说明TUBB2B(N247S)基因突变蛋白可抑制α微管蛋白的聚合。