微小RNA-148a-3p靶向核心1β13-半乳糖基转移酶1增强肺腺癌细胞的放疗敏感性的研究

目的探讨微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)在肺腺癌中的表达及临床意义,分析miR-148a-3p靶向蛋白核心1β13-半乳糖基转移酶1(C1GALT1)对肺腺癌细胞放疗敏感性的影响及机制。方法选取肺腺癌组织芯片中76例患者肿瘤组织及肺腺癌A549细胞株为研究对象。对组织芯片分别进行miR-148a-3p原位杂交(ISH)染色和C1GALT1免疫组织化学染色,分析76例肺腺癌患者肿瘤组织中miR-148a-3p的表达与临床病理、预后及C1GALT1表达的关系。采用细胞转染技术对A549细胞进行miR-148a-3p过表达质粒的转染;转染细胞接受2 Gy放疗后采用克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性;采用蛋白质印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与C1GALT1的靶向调控关系;采用共转染技术分析miR-148a-3p调控A549细胞放疗敏感性的机制。结果76例肺腺癌组织中低表达miR-148a-3p与患者淋巴结转移显著相关(P=0.012);miR-148a-3p高表达者预后显著优于miR-148a-3p低表达者(P=0.005);肺腺癌组织中miR-148a-3p与C1GALT1的表达呈显著负相关(P=0.023)。多因素分析显示,miR-148a-3p低表达、T分期及淋巴结转移是预后的独立危险因素。克隆形成实验显示,过表达miR-148a-3p组克隆形成数显著低于对照组(P<0.001);Western Blot结果显示,miR-148a-3p过表达可以显著下调细胞中C1GALT1蛋白水平(P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-148a-3p通过结合C1GALT1的3′UTR来调控C1GALT1的表达。功能拯救试验显示C1GALT1能够部分抵消miR-148a-3p的放疗增敏效应。结论肺腺癌中miR-148a-3p低表达与淋巴结转移、C1GALT1高表达及预后不良显著相关,miR-148a-3p通过负调控C1GALT1的表达增强肺腺癌细胞的放疗敏感性。

β-1,3-半乳糖基转移酶2对脑缺血损伤模型小鼠脑损伤的作用及其机制

目的探讨β-1,3-半乳糖基转移酶2(B3galt2)对脑缺血损伤模型小鼠脑损伤的作用及其机制。方法将成年雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham组)、大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型组、MCAO模型+慢病毒载体对照组(LV-GFP组)、MCAO模型+慢病毒载体过表达B3galt2组(LV-B3galt2组),每组6只。各组小鼠于脑缺血24 h后进行神经功能缺损评分和旋转棒实验,采用2,3,5-三氨基苯甲四氮唑染色测定脑梗死体积,采用尼氏染色法观察各组小鼠脑缺血半影区神经元数量,检测各组小鼠脑组织中氧化应激相关因子水平。结果与Sham组比较,MCAO模型组小鼠脑梗死体积增大,神经功能缺损明显(P<0.05),脑缺血区神经元数量明显减少,活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平明显升高(均P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平明显降低(均P<0.05);与MCAO模型组比较,LV-B3galt2组小鼠脑梗死体积减小,神经功能明显改善(P<0.05),脑缺血区神经元数量明显增加,ROS和MDA水平明显降低(均P<0.05),SOD和GSH水平明显升高(均P<0.05)。结论B3galt2过表达可以减轻脑缺血损伤模型小鼠脑损伤,其作用机制可能是通过抑制氧化应激反应实现的。

β-1,3半乳糖基转移酶-1和β-1,3半乳糖基转移酶-2在乳腺癌中的表达及临床意义

目的检测β-1,3半乳糖基转移酶-1(β-1,3-galactosyltransferase-1,B3GALT1)和β-1,3半乳糖基转移酶-2(β-1,3-galactosyltransferase-1,B3GALT2)在乳腺癌组织及癌旁正常组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系,并分析其相关通路。方法选取乳腺癌及癌旁组织标本132例,采用Western Blot法和免疫组化方法检测B3GALT1和B3GALT2在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达,分析其临床意义。通过基因集富集分析法探索相关通路。结果乳腺癌组织中B3GALT1和B3GALT2表达均低于癌旁正常组织(P<0.05),二者表达呈正相关(r=0.635,P<0.001),且两者表达阳性患者与阴性患者的T分期和Ki-67比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。B3GALT1和B3GALT2均富集于JAK-STAT通路和Notch通路。结论B3GALT1和B3GALT2在乳腺癌中低表达,与乳腺癌的增殖、生长密切相关。

256层CT灌注成像联合半乳糖凝集素-3在术前肺癌纵隔淋巴结转移诊断中的应用

目的:分析256层CT灌注成像参数(CTPI)联合半乳糖凝集素-3(Gal-3)在术前肺癌纵隔淋巴结转移诊断中的应用价值。方法:回顾性分析2022年4月-2023年4月收治的87例肺癌患者的临床资料,根据纵隔淋巴结转移情况分为转移组(n=45)和未转移组(n=42)。另选取2022年4月-2023年4月进行体检的健康人群作为对照组(n=40)。对所有受试者进行血清Gal-3水平检测,并采用Brilliance iCT扫描仪进行CT灌注扫描。比较三组CTPI[表面通透性(PS)、灌注值(PV)、肺动脉血流量(PAF)、血容量(BV)、平均通过时间(MTT)、强化峰值(PEI)、支气管动脉血流量(BAF)]和血清Gal-3水平,并采用受试者工作特征(ROC)曲线评估CTPI、血清Gal-3水平及联合检测在术前肺癌纵隔淋巴结转移中的诊断效能。结果:转移组PS,PV和Gal-3均高于未转移组和对照组,未转移组PS,PV和Gal-3均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析显示,PS值、PV及Gal-3水平联合检测肺癌纵隔淋巴结转移的线下面积高于各项单独检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:256层CTPI联合血清Gal-3检测对术前肺癌纵隔淋巴结转移具有较高的诊断价值,可为肺癌患者术前评估提供重要依据。

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因467C>T和539G>C变异导致A_2亚型

为了研究中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的分子遗传背景,发现并鉴定新的ABO等位基因,采用血型血清学方法鉴定5例ABO血型疑难样本,PCR扩增ABO基因转录调控序列和全编码序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序,并对含有变异位点的扩增片段进行单倍体序列分析。结果表明5例疑难样本分别鉴定为A2或A2B亚型;进一步研究发现,1例A2B和1例A2样本分别含有A201和A205等位基因,另3例A2B样本中发现一个新的A2等位基因。该等位基因与A101相比,差异在外显子7的467C>T和539G>C变异,导致多肽链P156L和R180P的替换。结论首次发现467C>T和539G>C组合的A2等位基因,中国汉族人群中A2亚型具有遗传多态性。

肝纤维化患者血清核心岩藻糖基化低分子量激肽原和α-半乳糖基化抗体的表达及预测价值

目的:肝纤维化是许多慢性肝脏疾病的共同病理基础,可进展至肝硬化,是肝脏疾病的主要致死因素,而早期识别并逆转肝纤维化进程是慢性肝病治疗的关键,本研究旨在比较血清核心岩藻糖标志物低分子量激肽原(core fucosylated low molecular weight kininogen,LMWK-Fc)和α-半乳糖基化(alpha-galactosidase,α-Gal)抗体在不同阶段肝纤维化患者体内的表达情况,评估其诊断肝纤维化的效能。方法:回顾性纳入2022年6月至2023年3月在中南大学湘雅二医院感染科就诊的275例慢性肝病患者,其中115例患者接受了肝活检。根据病理结果显示的肝组织内胶原沉积对肝结构破坏范围、程度和肝微循环影响的大小将115例完善肝活检的患者分为0~4期:S0,肝组织内无明显胶原沉积,肝结构和肝微循环正常;S1,肝组织内有轻度胶原沉积,部分破坏肝小叶结构,但肝微循环基本正常;S2,肝组织内中度胶原沉积,部分破坏肝小叶结构和肝微循环;S3,肝组织内广泛胶原沉积,大量破坏肝小叶结构和肝微循环;S4,发展为肝硬化,肝组织内高度胶原沉积,肝小叶结构完全破坏,肝微循环严重受损。并根据分期标准分为无肝纤维化组(S0)、肝纤维化组(S1~S2)、显著纤维化组(S3~S4)。160例未完善肝活检的患者则按照肝硬度值(liverstiffness measurement,LSM)分为无肝纤维化组(F0:LSM<7.3k Pa)、肝纤维化组(F1~F2:LSM为7.3~12.4 kPa)、明显肝纤维化组(F3~F4:LSM>12.4 kPa)。采集患者的年龄、性别等基本人口学资料以及丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、甲胎蛋白、血小板计数等实验室指标,计算肝纤维化-4指数(fibrosis-4 index,FIB-4)、天冬氨酸转氨酶/血小板比值指数(aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index,APRI),并对各项指标进行差异性分析;对入组的患者分别行血清LMWK-Fc和α-Gal抗体检测,比较各组间LMWK-Fc、α-Gal抗体及其他肝纤维化指标的表达情况;分析LMWK-Fc、α-Gal抗体表达水平与肝纤维化程度的相关性;采用受试者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清LMWK-Fc、α-Gal抗体水平预测肝纤维化的价值。结果:在未完善肝活检的160例患者中,血清α-Gal抗体及LMWK-Fc的表达水平在无肝纤维化组、肝纤维化组、明显肝纤维化组依次递增,差异有统计学意义(P<0.05)。在完善肝活检的115例患者中,血清LMWK-Fc水平在无纤维化组、肝纤维化组、显著肝纤维化组间依次增高,血清α-Gal抗体表达水平在显著肝纤维化组中高于无纤维化组、肝纤维化组,差异有统计学意义(P<0.001,P=0.032)。单变量和多元线性回归分析结果显示肝纤维化与性别、LMWKFc水平均有相关性(均P<0.05),与年龄、α-Gal抗体水平、FIB-4和APRI均无相关性(均P>0.05)。结论:血清LMWK-Fc和α-Gal抗体在不同分级肝纤维化患者血清中的表达水平存在差异,可能与肝纤维化进展有一定的相关性,LMWK-Fc水平对肝纤维化诊断具有一定的预测价值。

补肾化瘀方对PCOS患者血清半乳糖凝集素-3、IL-6及CRP水平的影响

目的 探讨补肾化瘀方治疗肾虚血瘀型多囊卵巢综合征(PCOS)患者的临床疗效及可能的作用机制。方法 将2020年9月至2021年9月期间,首次就诊于浙江省中西医结合医院生殖医学科门诊的60例肾虚血瘀型PCOS患者按照随机数字表法分为对照组和治疗组,各30例。对照组给予二甲双胍治疗,治疗组给予补肾化瘀方治疗,两组均治疗3个月经周期。观察治疗前后中医证候积分、性激素、糖脂代谢相关指标及半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、白介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)水平的变化情况。结果 治疗前,两组患者性激素、糖代谢相关指标、脂代谢相关指标、炎症因子水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,治疗组PCOS患者排卵率较对照组高(76.83%比49.43%,P<0.01)。与治疗前相比,两组患者中医证候积分[(4.18±2.58)分比(12.50±2.17)分,(6.07±2.94)分比(11.97±2.44)分,P<0.01]、空腹血糖[(5.05±0.45)mmol/L比(5.27±0.70)mmol/L,(4.92±0.56)mmol/L比(5.44±0.37)mmol/L,P<0.05]、空腹胰岛素[(9.66±4.54)mU/L比(13.48±4.73)mU/L,(8.44±2.81)mU/L比(12.20±5.19)mU/L,P<0.05]及胰岛素抵抗指数[(2.18±1.05)比(3.17±1.24),(1.89±0.76)比(2.99±1.42),P<0.05]降低。与对照组比较,治疗组中医证候积分降低[(4.18±2.58)分比(6.07±2.94)分,P<0.05],黄体生成素[(10.12±1.72)mIU/mL比(12.54±2.56)mIU/mL,P<0.05]、黄体生成素/卵泡刺激素[(1.65±0.32)比(1.95±0.40),P<0.05]、睾酮[(0.47±0.12)ng/mL比(0.57±0.16)ng/mL,P<0.05]水平降低,三酰甘油[(1.31±0.62)mmol/L比(1.66±0.56)mmol/L,P<0.05]、总胆固醇[(3.91±0.98)mmol/L比(4.40±0.70)mmol/L,P<0.05]、低密度脂蛋白[(2.60±0.61)mmol/L比(3.05±0.79)mmol/L,P<0.05]水平降低,高密度脂蛋白水平升高[(1.41±0.17)mmol/L比(1.31±0.17)mmol/L,P<0.05]。与对照组比较,治疗组Galectin-3 [(8.71±1.67)ng/mL比(9.91±2.23)ng/mL,P<0.05]、IL-6 [(30.24±3.85)pg/mL比(32.62±4.97)pg/mL,P<0.05]、CRP[(2.80±0.91)mg/L比(3.32±0.64)mg/L,P<0.05]水平降低。结论 补肾化瘀方可有效缓解肾虚血瘀型PCOS临床症状,降低血清炎症指标Galectin-3、IL-6及CRP水平,改善糖脂代谢紊乱,调节性激素水平,促进排卵。

适冷β-半乳糖苷酶及其在食品工业中的应用

β-半乳糖苷酶,又称乳糖酶,广泛存在于细菌、真菌、酵母菌等微生物中,主要功能是乳糖水解和合成低聚半乳糖。利用β-半乳糖苷酶生产低乳糖牛奶等乳制品成为解决乳糖不耐受问题最有效的途径,然而常用的商业化β-半乳糖苷酶的最适反应温度大多较高,对pH的要求比较严格,存在生产成本较高、消耗能量高等问题。适冷β-半乳糖苷酶在低温下也具有较高的酶活性,广泛应用于食品行业中,尤其在乳品工业。在低温下水解乳糖,生产低乳糖或无乳糖乳制品,供乳糖不耐受者食用,可降低成本、节约能源,具有重要意义。该文综述了β-半乳糖苷酶的微生物来源、特性、催化特性的研究现状,对适冷β-半乳糖苷酶的来源、特性、耐冷机制及工业化应用进行了系统阐述,并对其前景进行了展望。

β1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ对施万细胞增殖的影响

目的 探讨周围神经施万细胞表达 β1,4 半乳糖基转移酶 Ⅰ (β 1,4 GalT Ⅰ )对其增殖的影响。 方法 将构建的正、反义 β 1,4 GalT Ⅰ表达质粒 ,转染到施万细胞中 ,分析转染细胞倍增时间、3H TdR掺入情况以及细胞周期变化。 结果 转染正义β 1,4 GalT Ⅰ后施万细胞的增殖受到抑制 ,这种作用随转染浓度增大而增强 ;在G1 /G0 期的细胞数目增加 ,S期的数目减少。而转染反义 β 1,4 GalT Ⅰ有相反的作用。 结论 β 1,4 GalT Ⅰ对施万细胞的增殖有抑制作用 ,可能在周围神经施万细胞的增殖调节中发挥重要作用。

半乳糖上调内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平抑制巨噬细胞活性

目的探究半乳糖对人原代肺动脉内皮细胞上唾液酸特异性Ig样凝集素-9(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin 9,Siglec-9)聚糖配体表达的影响及作用机制。方法采用流式细胞术确定内皮细胞表面Siglec-9聚糖配体的表达并鉴定该聚糖配体末端糖苷键类型;分别用左旋葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰基葡萄糖、甘露糖、N-乙酰基甘露糖、半乳糖、唾液酸、蔗糖处理内皮细胞48 h,采用流式细胞术检测内皮细胞Siglec-9聚糖配体的表达;将内皮细胞分为对照组和半乳糖组(n=3),Western blot、流式细胞术、免疫荧光分析半乳糖对内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达的影响;α2-3,6,8唾液酸酶处理内皮细胞后,Western blot检测半乳糖对内皮细胞Siglec-9聚糖配体恢复时间的影响;半乳糖处理内皮细胞后,Western blot检测分析细胞内唾液酸合成关键酶(GNE、NANS、NANP、CMAS、NPL以及ST3Gals)表达水平,并用RT-qPCR验证相关蛋白的mRNA表达;siRNA敲低NANP、CMAS及ST3Gal-Ⅲ,Western blot检测内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平变化;巨噬细胞与内皮细胞共培养实验分析Siglec-9聚糖配体的增加对巨噬细胞的凋亡与吞噬能力的影响。结果内皮细胞上表达有Siglec-9聚糖配体且该配体为末端结构为α2-3连接的唾液酸糖蛋白;与对照组比较,半乳糖组内皮细胞上该聚糖配体表达水平显著增加(P<0.01),但半乳糖的添加对该配体的自我恢复时间无影响;与对照组比较,半乳糖处理的内皮细胞中NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ表达水平升高(P<0.05,P<0.01),且RT-qPCR验证结果与其一致;抑制内皮细胞中NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ的表达后,内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平下降(P<0.01)。共培养实验中,与未处理组比较,半乳糖处理的内皮细胞促进巨噬细胞凋亡增加(P<0.01),并导致其吞噬能力减弱(P<0.05)。结论半乳糖通过NANP-CMAS-ST3Gal-Ⅲ通路上调内皮细胞上Siglec-9聚糖配体水平,从而抑制巨噬细胞活性。

ERK在TNF-α诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I表达中的作用

目的研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-GalT-I)表达的调节作用。方法用不同浓度的TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并作用不同的时间,检测β-1,4-GalT-I表达变化;应用ERK通路抑制剂U0126预处理HUVECs,再用TNF-α刺激HUVECs,检测β-1,4-GalT-I的表达变化,并通过内皮-单核细胞黏附试验观察HU-VECs黏附能力的改变。结果 TNF-α诱导HUVECsβ-1,4-GalT-I表达增加,且具有剂量和时间依赖关系;U0126显著抑制TNF-α引起的HUVECsβ-1,4-GalT-I表达的上调及其黏附能力的上调。结论 ERK信号转导通路可能参与调节TNF-α诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-I的表达,并影响内皮细胞的黏附能力。

β-1,4-半乳糖基转移酶抑制剂的研究进展

β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-GalT)抑制剂的研究是当今糖化学和糖生物学的前沿研究领域之一。本文就β-1,4-GalT抑制剂(包括供体类似物、受体类似物、过渡态类似物)的设计、合成及活性评价诸方面予以综述。

半乳糖凝集素-3基因敲除对MRSA感染小鼠皮肤模型中脓肿发展的影响

目的探讨半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal3)在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染小鼠皮肤模型中对皮肤脓肿发展以及肥大细胞(mast cell,MC)激活的影响。方法将6~8周龄的野生型小鼠和Gal3基因敲除(Gal3^(-/-))小鼠分为4组:野生型小鼠+PBS组、野生型小鼠+MRSA组、Gal3^(-/-)小鼠+PBS组、Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组,分别皮下注射MRSA或PBS,每组5只。观察记录小鼠皮肤脓肿发展和病理学变化,比较皮肤组织中的载菌量,并分析相关炎性细胞因子、MC脱颗粒及活化标志物5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)的差异。结果感染MRSA后,野生型小鼠皮肤出现渐进性脓肿,而Gal3^(-/-)小鼠脓肿体积较小。与野生型小鼠+MRSA组相比,Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组皮肤载菌量显著降低(P<0.01),且组织病理学观察显示较少的炎症细胞浸润。Gal3^(-/-)小鼠皮肤中的细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-33、TGF-β和IL-10均显著低于野生型小鼠(P<0.05)。甲苯胺蓝染色显示,野生型小鼠+MRSA组皮肤组织中大量MC释放颗粒物质,而Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组仅发现少量脱颗粒的MC。免疫组化染色进一步发现,Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组中5-HT的表达显著低于野生型小鼠+MRSA组。结论Gal3缺失降低MRSA感染导致的小鼠皮肤中MC的活化与脱颗粒,改变炎症反应,减轻了皮肤组织的脓肿发生。

N-糖链合成相关β-1,4-半乳糖基转移酶在大鼠坐骨神经损伤后的表达变化

为了分析与 N-糖链合成相关β-1,4-半乳糖基转移酶 - 、 、 (β-1,4-galactosyltransferase , , ,β-1,4-Gal T- , , ) m RNA在正常和损伤坐骨神经组织的表达变化。本研究采用 RT-PCR方法 ,分析 β-1,4-Gal T- 、 、 在小鼠坐骨神经中的表达存在。以扩增的 c DNA片断标记探针 ,Northern blot分析β-1,4-Gal T- 、 、 m RNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的表达变化。结果表明 :通过 RT-PCR方法 ,检测到 β-1,4-Gal T- 、 、 在小鼠坐骨神经中的表达存在 ;采用 Northern blot方法 ,发现β-1,4-Gal T- 、 、 在正常大鼠坐骨神经中有表达 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化 ,但三种同功酶的表达变化各不相同。结论 :本实验发现 β-1,4-Gal T- 、 、 在坐骨神经有表达 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化。提示与

miR-27a-3p抑制β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ表达对胃癌SGC-7901细胞的影响

目的目前关于胃癌中miRNAs靶向调控β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ(B4GALT3)表达的具体机制尚不明确。文中旨在分析miR-27a-3p对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移及侵袭的影响,探讨其分子机制。方法生物信息学预测B4GALT3基因的靶miRNAs,针对B4GALT3′UTR与靶miRNA结合位点构建荧光素酶报告基因载体,检测其相对荧光素酶的活性;将miR-27a-3p mimic、mimic NC、control(空白对照)、miR-27a-3p inhibitor、inhibitor NC分别瞬转入SGC-7901细胞后,Western blot检测各转染细胞B4GALT3的表达情况;采用MTT、迁移、侵袭实验检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结果与正常胃黏膜GES-1细胞比较,B4GALT3在胃癌各个细胞系中表达显著上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-27b-3p能使野生型B4GALT3的荧光素酶的活性显著性降低(P<0.001),说明miR-27a-3p与B4GALT3存在靶向关系。Western blot检测结果显示,瞬转miR-27a-3p mimic后,B4GALT3蛋白水平下降(P<0.05);瞬转miR-27a-3p inhibitor后,B4GALT3表达升高(P<0.01),说明miR-27a-3p对B4GALT3有负性调控作用。24、48、72、96、120 h,与mimic NC、空白对照比较,miR-27a-3p mimic的细胞增殖显著升高(P<0.05);与inhibitor NC、空白对照比较,miR-27a-3p inhibitor的细胞增殖显著降低(P<0.05)。miR-27a-3p mimic的迁移细胞数量[(319.3±13.9)个]较mimic NC[(218.0±10.7)个]明显增加(P<0.000);侵袭细胞数量[(402.0±15.0)个]较mimic NC[(241.0±17.3)个]明显增加(P<0.000)。miR-27a-3p inhibitor迁移细胞数量[(115.6±13.8)个]较inhibitor NC[(214.6±6.8)个]明显减少,迁移能力明显降低(P<0.000)。结论miR-27a-3p通过抑制B4GALT3表达,促进胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭能力,为寻找胃癌治疗靶点提供了实验依据。

β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在树突状细胞中的表达及作用

目的:观察β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ)在人外周血来源的树突状细胞(Dendritic cells,DCs)中的表达与定位,研究其对DCs免疫功能的影响。方法:人外周血单核细胞经GM-CSF+IL-4+TNF-α诱导培养分化为DCs,采用RT-PCR、流式细胞术和激光共聚焦技术观察DCs中β-1,4-GalT-Ⅰ的表达与定位;通过细胞粘附试验分析β-1,4-GalT-Ⅰ表达与细胞粘附能力的关系。用α-乳清蛋白(α-lactalbumin,LA)作为细胞表面β-1,4-GalT-Ⅰ抑制剂,研究β-1,4-GalT-Ⅰ在DCs细胞粘附以及与CD4+Th细胞形成免疫突触过程中的作用。结果:在人外周血来源DCs细胞表面和细胞浆内可表达长型和短型β-1,4-GalT-Ⅰ;长型β-1,4-GalT-Ⅰ或细胞表面β-1,4-GalT-Ⅰ的表达水平与细胞粘附能力呈正相关;α-LA既可抑制DCs对层粘连蛋白的粘附,又可抑制DCs与CD4+Th形成免疫突触。结论:β-1,4-GalT-Ⅰ在DCs中表达,他们作为粘附分子参与细胞粘附和免疫突触形成。

细胞表面β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在免疫突触形成中的作用

目的:研究细胞表面β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-I)在免疫突触形成中的作用。方法:以抗CD3、CD28单克隆抗体活化Jurkat细胞,应用实时荧光定量PCR及流式细胞术检测分析β-1,4-GalT-I的表达变化,激光共聚焦显微镜观察β-1,4-GalT-I在Jurkat细胞活化前后的表达与定位;将Jurkat细胞与SEB负载的Raji细胞共培养以构建Jurkat-Raji细胞免疫突触,观察β-1,4-GalT-I在免疫突触中的定位。结果:β-1,4-GalT-I mRNA表达水平随着Jurkat细胞的活化逐渐增高,在细胞活化后36小时达到高峰;活化后细胞表面β-1,4-GalT-I分子的表达较静止状态高;共聚焦显微镜显示在活化的Jurkat细胞表面及Jurkat-Raji细胞免疫突触部位β-1,4-GalT-I表达信号增强且其分布发生重排和簇集,且与CD3分子共定位,与CD28分子部分共定位。结论:Jurkat细胞表面的β-1,4-GalT-I分子参与了免疫突触的形成。

空肠弯曲菌β1,3-半乳糖基转移酶(CgtB)突变体的设计及活性鉴定

来自空肠弯曲菌的β1,3-半乳糖基转移酶(CgtB)主要负责蛋白质O-连接糖基化的第二步延伸,在O-连接N-乙酰半乳糖胺(O-GalNAc)修饰后面添加一个半乳糖,目前CgtB已经被广泛应用于体外O-连接糖基化的合成。为了开发O-GalNAc修饰的识别工具,CgtB蛋白质用于突变体设计。在基因水平删除N端30个氨基酸及C端的30个氨基酸得到Cgt1,将Cgt1构建在pMal-c5x表达质粒上并通过大肠杆菌进行原核表达。可溶性的Cgt1经过麦芽糖结合蛋白(MBP)亲和层析柱进行纯化并利用糖结合实验进行活性分析。结果显示,大肠杆菌体系可以成功表达可溶性重组Cgt1蛋白质,相对分子质量约为70000,重组的Cgt1具备结合O-GalNAc修饰蛋白质的活性;针对不同的标准糖蛋白,Cgt1只识别含有O-GalNAc修饰的黏蛋白(mucin);对于复杂的细胞样品,Cgt1可以特异性识别细胞内的O-GalNAc修饰。该研究开发的识别O-GalNAc修饰工具,为进一步研究O-GalNAc修饰的功能奠定了基础。

奶牛β-1,4-半乳糖基转移酶基因在毕赤酵母GS115中的转化表达及发酵优化

采用电转化法将已构建好的表达载体pPIC9K-GT转化到毕赤酵母(Pichina pastoris)GS115中。通过对电转化条件进行优化,达到了理想的转化效率,得到了大量转化子,并通过表型筛选及PCR鉴定,筛选到阳性转化子。对重组的P.pastoris GS115-GT进行了诱导表达,用SDS-PAGE法检测到目的蛋白质条带,证明β-1,4-半乳糖基转移酶基因(GT)在P.pastoris GS115中能够表达;用苯酚红法测定了粗酶液的活性,其比酶活为16.40 U/ml。对工程菌的发酵条件进行了初步优化,在最佳工艺下的比酶活达到30.909 U/ml,比优化前提高了88.47%。

知母-黄柏药对改善D-半乳糖诱导衰老小鼠认知障碍的机制研究

目的:研究知母-黄柏药对(简称“知柏”)对D-半乳糖(D-gal)诱导衰老模型小鼠认知障碍的改善作用,并探讨其作用机制。方法:将75只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组(D-gal 125 mg/kg)、吡拉西坦组(468 mg/kg)、知柏组(4.5 g/kg)和雷帕霉素哺乳靶蛋白(mTOR)抑制剂组(依维莫司,RAD001,3mg/kg),每组15只。通过D-gal建立小鼠衰老模型,并连续8周灌胃给予知柏水煎液。采用Morris水迷宫和新物体识别测试评价衰老模型小鼠的认知功能;HE染色法观察各组小鼠海马组织病理变化情况;尼氏染色和高尔基染色观察海马区神经元和突触的病理形态变化;收集海马组织以测定脑内三磷酸腺苷(ATP)含量,Western Blot法检测海马中泛素结合蛋白62(P62)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin-1)、突触素(Syn)、突触后密度蛋白-95(PSD-95)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、mTOR的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测海马中Syn、AMPK、mTOR基因表达水平。结果:与空白组相比,模型组小鼠在Morris水迷宫和新物体识别测试中表现出认知功能显著降低(P<0.01)。在模型组中,海马区的细胞数量减少,细胞排列松散,神经元形态不规则,尼氏小体数量明显减少,树突分支数量以及树突棘密度也显著减少。模型组小鼠海马中ATP水平、P62、Syn、PSD-95、mTOR蛋白表达显著降低(P<0.01),Beclin-1表达显著升高(P<0.01),pAMPK/AMPK蛋白含量比值和AMPK基因表达显著升高(P<0.01),Syn和mTOR基因表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,吡拉西坦组和知柏组小鼠的认知功能得到了显著改善,表现为Morris水迷宫测试中潜伏期的显著缩短(P<0.01),穿越平台次数和靶象限停留时间显著增加(P<0.01),以及新物体识别指数的显著升高(P<0.01),海马区树突棘密度显著增加(P<0.01),神经元损伤也在一定程度上得到了缓解。海马中ATP水平、P62、Syn、PSD-95和mTOR蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05),Beclin-1蛋白表达显著降低(P<0.01),pAMPK/AMPK蛋白含量比值和AMPK基因表达显著降低(P<0.01,P<0.05),Syn、mTOR基因表达显著升高(P<0.01)。抑制剂RAD001组与模型组结果相似,经知柏治疗后上述指标均有所回调。结论:知柏可能通过激活AMPK/mTOR信号通路抑制神经元过度自噬,增强突触可塑性,改善由D-gal引起的小鼠认知障碍。