龙牙楤木Aeβ-AS基因的表达对烟草中皂苷含量的影响

为探讨龙牙楤木(Aralia elata)三萜皂苷合成的关键酶基因β-香树素合成酶基因(Aeβ-AS)对三萜皂苷合成的影响。利用基因克隆技术对Aeβ-AS基因进行克隆,并对烟草进行遗传转化,分析转基因烟草中Aeβ-AS基因在各部位的表达差异,检测Aeβ-AS基因及上下游关键酶基因表达量和总三萜含量。结果表明:成功构建了植物过表达载体pROKⅡ-Aeβ-AS,并转入了野生型烟草,获得7个转基因株系,并在mRNA水平表达,且在叶子中的表达量要高于根和茎;在转基因烟草中,Aeβ-AS基因及其上下游的关键酶基因表达量均高于野生型,其中株系L21的NtFPS、NtSS基因的相对表达量最高,株系L30的NtSE、Aeβ-AS基因的相对表达量最高;与野生型烟草相比,转基因烟草的总三萜含量显著升高(1.1~1.6倍)。试验结果证明合成Aeβ-AS基因并在烟草中进行异源转化,可以使转基因烟草内的总三萜含量显著升高。

甘草β-AS基因时空表达模式研究

目的:揭示甘草β-AS基因表达的时间特异性及空间特异性。方法:通过PCR扩增获得不同时间、不同部位甘草β-AS基因的cDNA序列,琼脂糖凝胶电泳后用Gel-Pro分析软件对电泳条带进行光密度分析,计算其相对表达量。结果:空间特异性实验显示β-AS基因在甘草的地上部分没有表达,地下组织中,新陈代谢最旺盛的根尖部分表达量高于根茎。时间特异性实验显示甘草β-AS基因在全年中的表达水平可分为4个阶段。12月至2月,β-AS基因表达低于检测水平;3月至5月,β-AS基因开始表达,表达量逐渐上升;5、6及8、9月,β-AS基因表达量保持较高水平;10、11月表达量开始下降。结论:在研究甘草β-AS基因时,应该选取转录水平较高的5、6及8、9月份;选取转录水平较高的根尖作为提取总RNA的部位。

基于β-AS基因的甘草道地性形成机制研究

目的:对甘草道地性形成机制进行探索。方法:在GenBank中检索β-香树酯醇合成酶(β-AS)基因,进行序列比对并找出序列保守区,用primer premier 5.0软件设计引物,对3个不同产地甘草材料的β-AS基因进行扩增、测序,用MegAlign软件进行序列分析并构建系统树。在表达差异实验中,对来自3个产地的9份甘草材料进行总RNA提取,逆转录得到cDNA,以甘草18S基因为内参,PCR扩增后进行相对表达量分析。结果:在序列多态性实验中,9个样品的β-AS序列经比对分析共发现108处变异位点,内含子变异位点数高于外显子变异位点数两倍。在表达差异实验中内蒙组、甘肃组和宁夏组的甘草β-AS基因平均相对表达量有显著性差异。结论:不同产地甘草β-AS基因多态性的差异以及表达量的差异,可能是导致甘草道地性形成的原因之一。

洋常春藤β-AS基因的全长克隆与表达分析

β-香树素合成酶(β-AS)是三萜皂苷生物合成途径中关键酶基因,可以催化形成齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的骨架结构。本研究利用RACE克隆技术克隆并分析了洋常春藤中的β-AS基因,结果表明:洋常春藤β-AS基因的c DNA全长2784 bp,命名为Hhβ-AS(Gen Bank登录号:KU942522),其包含编码763个氨基酸的开放阅读框。预测该基因编码的蛋白质分子量为87.8 k D,理论等电点为5.94。经过氨基酸序列比对,结果表明洋常春藤中的β-AS与刺楸的β-AS同源性最高,达到96%。通过RT-q PCR分析Hhβ-AS基因在洋常春藤中的时空表达规律,表明Hhβ-AS基因与常春藤皂苷含量之间存在明显的正相关性,为探讨其在常春藤皂苷生物合成途径中的作用以及深入的研究该基因的分子调控机制奠定基础。

基于β-AS基因多态性的金铁锁核心种质构建

金铁锁是"云南白药"的重要组分,为我国西南地区的特有二级濒危保护植物。其野生资源已不能满足医药生产的需求,亟需通过对其种质资源进行研究,构建金铁锁核心种质。为金铁锁种质改良、分子育种等奠定基础。该研究采用了关键酶基因(β-AS)作为核基因标记对金铁锁进行了谱系地理学研究。研究结果显示,在所有居群中,总共检测到36个单倍型,单倍型多样性(Hd=0.905)较高,居群间存在一定的遗传分化(GST=0.280)。AMOVA结果显示,金铁锁居群内遗传多样性较低(22.57%),居群间的遗传变异占77.43%。单倍型分布结合网状进化分析结果显示,Hap1为普通单倍型,且位于网状图的中心位置,可判断为祖先单倍型。Hap2,Hap4,Hap15,Hap16共享单倍型,剩余的为居群特有单倍型。在此基础上,为了最大限度的保存金铁锁的遗传多样性,依据药用植物核心种质构建的标准提出了金铁锁核心种质的构建策略。