层理鞭枝藻藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基Cys-155的藻胆色素共价偶联

层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus PCC7603)藻蓝蛋白β-CPC和藻红蓝蛋白β-PEC中均存在2个藻胆色素结合位点(Cys-84和Cys-155),可与藻蓝胆素(简称PCB)发生共价偶联反应,已有研究证实编码基因为alr0617的裂合酶CpcS1是催化Cys-84与PCB共价偶联的裂合酶。在研究Cys-155与PCB共价偶联的过程中,通过BLAST软件同源性对比分析后,筛选出4个基因:cpcT1、cpcT2、cpcS1、cpcS,其中基因cpcT1和cpcS2,利用分子克隆的技术,根据实验需要转到载体pCDFDuet上,通过DNA电泳和蛋白质电泳挑选出正确的克隆。此4个基因对应的质粒与在大肠杆菌内生成PCB必需的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA,以及质粒pET-cpcB(C84S)或pET-pecB(C84A),共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,得到各重组蛋白,经过亲和层析柱提纯并透析,过滤掉金属离子,纯化透析后的蛋白经过活性比较、蛋白质电泳以及锌染色、蛋白质变性等试验以及荧光和紫外吸收光谱等鉴定,通过与相应文献中PCB光谱的比对,确定编码基因为all5339的裂合酶CpcT1能高效地催化Cys-155与PCB共价偶联,而其余3个基因不能起到催化作用。由此,能催化脱辅基蛋白β-CPC和β-PEC的两个位点共价偶联PCB的裂合酶均被发现。实验对于研究藻胆蛋白的生物合成、光合作用捕光机理以及藻胆体的组装等有重要的意义。

藻蓝蛋白裂合酶CpcS1与CpcT1的复合物初步研究

研究证实裂合酶CpcS1、CpcT1能分别催化藻蓝蛋白β亚基(简称CpcB)的两个色素结合位点(84位和155位)共价偶联藻蓝色素PCB(phycocyanobilin),但通过实验发现仅CpcS1和CpcT1共同催化CpcB无法生成天然构像的色素蛋白.为了挑选出辅助裂合酶,经过综合分析,筛选出6个与CpcS1、CpcT1同源的裂合酶.将编码裂合酶的基因按照本实验的需求,重新构建在其它载体上,在大肠杆菌BL21体内表达出蛋白后,分别与CpcS1、CpcT1混合,利用亲和层析分离,然后通过蛋白质电泳图谱初步分析裂合酶之间形成复合物的情况.能形成复合物的裂合酶,再与CpcS1、CpcT1及脱辅基蛋白共同转入大肠杆菌BL21体内进行体内重组研究.结果表明,CpcT1能分别与CpcS1、CpcT2、PecF形成复合物,但这些复合物均不能辅助催化CpcB生成天然产物.