果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺含量检测方法及尿素循环障碍患者食用分析

本研究基于酶解结合超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技术,开发了一种测定蔬菜和水果中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法。利用灰色链霉菌蛋白酶酶解样品,并加入抗氧化剂丁基羟基苯甲醚,再取上清液进行UPLC-MS/MS分析;以甲醇-0.02%甲酸溶液作为流动相进行梯度洗脱,经Phenomenex kinetex F5色谱柱分离,用电喷雾电离源正离子扫描和多反应检测模式进行检测,并通过内标法定量。天冬酰胺和谷氨酰胺在10~1 000 ng/mL范围内线性关系良好(R^(2)>0.999)。方法检出限为1.5 mg/100 g,定量限为5.0 mg/100 g,回收率在80.0%~112.8%,相对标准偏差为1.2%~9.1%。对市场常见的49种蔬菜和50种水果进行检测,结果表明在蔬菜中天冬酰胺、谷氨酰胺的总含量均值从高到低排序为豆类、薯芋类、葱蒜类、菌类、瓜类、茄果类、白菜类、绿叶菜类,其中豆类的天冬酰胺、谷氨酰胺总含量均极显著高于绿叶菜类(P<0.01);在水果中天冬酰胺、谷氨酰胺的总含量均值从高到低依次为核果类、西甜瓜类、聚复果类、浆果类、柑果类、香蕉类、壳果类,核果类的天冬酰胺、谷氨酰胺总含量均显著高于壳果类(P<0.05)。本研究结果提示尿素循环障碍患者在日常膳食中可以更多地摄入绿叶菜类、壳果类等天冬酰胺、谷氨酰胺含量少的果蔬,特别是支链氨基酸与(天冬酰胺+谷氨酰胺)含量比值较高的小白菜、木耳、大葱、椰汁、桂圆、柚子等果蔬。另外,应减少对土豆、南瓜、长豆角、香瓜、红李、黄桃等比值较低果蔬的摄入。

Boc-L-天冬酰胺与正己胺的缩合反应研究

氨基酸因含有氨基、羧基等活性基团,易于对其结构进行调控,是构筑小分子有机凝胶的常用骨架或切块。以天冬酰胺为基本骨架,将羧酸位点与正己胺进行缩合反应,形成酰胺键,是一种良好的凝胶因子中间体。研究了Boc-L-天冬酰胺与正己胺的缩合反应,考查了有机碱、反应溶剂和反应温度对反应的影响。条件优化之后发现使用DCC作为缩合剂,DIPEA提供碱性环境,25℃下在DCM溶剂中反应,反应收率可达74%。合成的目标化合物结构经过~1H NMR表征确认,该工艺条件温和,操作简单,效率高。

构建转天冬酰胺酶基因菌株及其固体发酵产酶培养基优化

构建一株转L-天冬酰胺酶基因的里氏木霉重组菌株,并采用固体发酵的方法研究其发酵产酶。首先以贝莱斯芽孢杆菌质粒为骨架重组天冬酰胺酶基因,验证其天冬酰胺酶的表达;随后探讨不同培养基配方(配方1和配方2)发酵产酶效果,通过单因素和正交试验优化其优势产酶培养基。结果表明:构建的里氏木霉可以正确表达天冬酰胺酶;在固体培养基配方1和配方2中,重组的里氏木霉菌株发酵产天冬酰胺酶分别为4.52 U/g和2.21 U/g,配方1产酶量远高于配方2。因此,以配方1作为优选配方,通过单因素及正交试验对其进一步优化。配方1中,当麦麸与玉米芯的比例为3∶1、初始含水量为1∶4.4、初始pH值为5.5时,该里氏木霉转L-天冬酰胺酶基因重组菌株发酵产酶活力为5.965 U/g,与原配方相比,优化后的固体培养基发酵产酶活力提高了24.22%。

天冬酰胺酶超分子脂质纳米粒在大鼠体内的药代动力学与药效学研究

目的研究天冬酰胺酶磺丁基-β-环糊精超分子脂质纳米粒(ASLN)在大鼠体内的药代动力学行为,并初步探讨其对小细胞肺癌细胞增殖的抑制作用。方法采用逆相蒸发法制备ASLN,考察其形态、粒径、zeta电位和包封率。12只SD大鼠随机分为2组,每组6只,分别静脉注射ASLN和游离天冬酰胺酶(Aase)2 kU/kg后,于48 h内的不同时间点取大鼠眼眶血测定血浆样品中Aase的活性,并绘制活性-时间曲线,采用DAS 2.1.1软件计算药代动力学参数。采用MTT法检测ASLN对小细胞肺癌细胞H446的细胞毒性作用。结果ASLN呈球形或类球形,其粒径为(321.27±1.42)nm,zeta电位为(-9.31±0.42)mV,包封率为(66.46±1.57)%。ASLN和Aase的0~48 h活性-时间曲线AUC分别为(199.48±2.18)、(57.63±3.89)U·mL^(-1)·h,平均滞留时间分别为(4.40±0.05)、(2.09±0.07)h,峰浓度分别为(35.49±1.11)、(27.58±1.28)U/mL。ASLN相对Aase的生物利用度为325.96%。细胞毒性结果表明,ASLN对H446细胞具有增殖抑制作用,抑制率与其浓度呈正相关。结论ASLN能改善Aase的药代动力学行为,提高Aase的生物利用度,并抑制小细胞肺癌细胞的增殖。

α,β-聚-DL-天冬酰胺衍生物水凝胶的合成及其溶胀性能研究

以ＤＬ天冬氨酸为单体，通过缩合聚合反应合成聚ＤＬ丁二酰亚胺，然后用不同比例的乙醇胺和丁二胺进行开环和交联，获得α，β聚ＤＬ天冬酰胺衍生物水凝胶．测定了水凝胶在几种不同溶液中的溶胀比，结果表明该水凝胶在蒸馏水中的溶胀比为１１０～４４０倍，在不同浓度的盐溶液中的溶胀比有不同程度的降低，在０１６ｍｏｌ／Ｌ的抗肿瘤药物５氟尿嘧啶（５Ｆｕ）水溶液中的溶胀比可达１４０倍．研究了聚丁二酰亚胺分子量、溶剂用量及交联剂用量等因素对凝胶溶胀性能的影响．

5-氟尿嘧啶-聚α,β(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺的合成及体内释放的研究

以５氟尿嘧啶为模型药物，将药物以共价键的形式键合于生物降解型高分子材料聚α，β（２羟乙基）ＤＬ天冬酰胺上制成高分子载体药物，药物接入率达３７１％（ｗ／ｗ）。用红外和差热分析法对载体药物进行了表征。以纯种大白兔为实验动物，把载体药物制成混悬型和棒状型两种剂型，进行药物体内释放实验。结果表明：以棒状型药物给药在一定程度上可以降低释药初期的“爆释”现象，为进一步临床应用提供了重要依据。

几种因素在L-天冬酰胺酶化学修饰中对酶活力及抗原性的影响

为了寻求在较好地保持酶活力的同时解除L-天冬酰胺酶抗原性的方法,采用不同分子量的乙酸酐、右旋糖酐和单甲氧基聚乙二醇,作为修饰剂和不同的修饰方法对该酶进行了化学修饰。结果表明在保持酶活性和降低抗原性方面,大分子修饰剂右旋糖酐、单甲氧基聚乙二醇优于小分子乙酸酐,底物保护修饰优于直接修饰;活化PEG,优于活化PEG_1。在底物保护下的PEG,修饰酶其抗原性完全解除的同时,酶活力保持在30%以上。

葡聚糖磁性毫微粒固定化L－天冬酰胺酶的研究

葡聚糖磁性毫微粒固定化Ｌ－天冬酰胺酶的研究徐慧显，李民勤，潘再群，马建标，何炳林（南开大学高分子化学研究所，天津３０００７１）大肠杆菌天冬酰胺酶对急性淋巴白血病有明显疗效［１］，注射入体内以后，可迅速清除血清中的天冬酰胺──敏感性肿瘤细胞的必需营养成...

高分子载体α，β－聚（羟烷基）－DL－天冬酰胺的合成及分子量测定

以ＤＬ－天冬氨酸为单体，聚合成ＤＬ－天冬酸胺，接入不同悬臂氨基乙醇，氨基内醇，氨基丁醇，得到α，β－聚（羟烷基）－ＤＬ－天冬酰胺，分别是α，β－聚（２－羟乙基）－ＤＬ－大冬酰胺（ＰＨＥＡ），α，β－聚（３－羟丙基）－ＤＬ－天冬酰胺（ＰＨＰＡ），α，β－聚（４－羟丁基）－ＤＬ－天冬酰胺（ＰＨＢＡ）。用红外光谱表征了高分子载体，比较了不同投料比对反应的影响；测定了高分子载体的比浓粘度，建立了ＰＨＰＡ的Ｍａｒｋ—Ｈｏｕｗｉｎｋ方程。

丝素纳米颗粒的制备及应用于L-天冬酰胺酶的固定化

丝素蛋白纤维溶于高浓度中性盐溴化锂溶液或氯化钙-乙醇-水三元溶剂中,经过透析和纯化可以制成3种液态丝素.SDS-PAGE分析结果表明,其分子量分布范围明显不同.应用能与水混溶的有机溶剂如丙酮等可将这种丝素制成丝素纳米颗粒,用SEM观察到丝素纳米颗粒粒径分布范围为50～120nm.以戊二醛为交联剂,将治疗急性淋巴性白血病常用酶制剂L-天冬酰胺酶共价结合在丝素纳米颗粒上.酶活性分析结果表明,由肽链断裂较少的丝素制备的纳米颗粒更适合于酶的生物结合.酶动力学研究结果表明,这种固定化酶活性回收率为44%,热稳定性较游离酶有明显提高,最适pH值范围加宽为6.0～8.0,最适反应温度提高10℃;抗胰蛋白酶水解能力明显增强.结果表明,丝素纳米颗粒与丝素蛋白膜一样,是一种酶固定化的良好载体,在药物缓释系统方面具有潜在的研究和开发价值.

L-天冬酰胺酶工程菌株培养条件及稳定性

Ｌ天冬酰胺酶工程菌株的酶活和表达水平受菌体生物量和诱导时间的影响。在生物量Ａ６０００３ ×１０ 左右，热诱导４ｈ 酶活力和表达水平可达到较高水平。葡萄糖对酶的生成有阻遏作用，当葡萄糖浓度大于０２５ ％ 时，对工程菌酶的合成造成阻遏。确定了工程菌培养的培养基、ｐＨ 值、接种量等因素。重组质粒ｐＡＳＮ 在Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５ ，ＴＧ１ 和ＡＳ１３５７ 等宿主菌中具有很好的稳定性，工程菌培养５０ 代以上重组质粒保留９０ ％ 以上，在ＬＢ 和Ｍ３

乙酰水杨酸－聚天冬酰胺棒状药物体外释放的研究

以乙酰水杨酸为模型药物，将药物以共价键键合于聚天冬酰胺高分子母体，制成棒伏。体外释放在Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ＰＨ７．４）缓冲溶液介质中，温度为３７±０．１℃时，其释放初期的释药量为其膜剂的近１／３０，能较好地控制释药初期的“爆释”现象。

不同裂解条件对天冬酰胺主要裂解产物的影响

采用在线裂解气相色谱-质谱联用技术(Py/GC-MS)对不同条件下天冬酰胺的主要裂解产物进行分析,并通过裂解同位素标记样品,计算主要含氮裂解产物中的同位素比例,推测其形成途径,研究裂解条件对主要裂解产物形成的影响。结果表明:温度对天冬酰胺裂解影响较大,主要裂解产物在低温和高温下生成量变化较大。300℃时,马来酰亚胺和琥珀酰亚胺为主要的裂解产物,300～600℃时生成量显著增加,600～900℃时马来酰亚胺生成量缓慢增加而琥珀酰亚胺逐渐降低;随着温度升高,酸类和酰胺类物质生成量持续增加;腈类和吡咯类物质在高温下生成量明显增加。此外,温度对含氮裂解产物的形成途径也有较大影响。马来酰亚胺、乙酰胺在低温下N主要来源于标记的酰胺N,而在高温下主要来源于未标记的氨基N。氢氰酸、乙腈和丙烯腈中的N原子均主要由未标记的氨基转变而来,且随着温度升高,这种生成途径所占比例越高。而裂解气氛和裂解时间对天冬酰胺主要裂解产物的生成量及途径影响较小。

L-天冬酰胺酶Ⅱ基因工程菌的培养

为提高L 天冬酰胺酶Ⅱ基因工程菌EscherichiacolipKA/CPU2 10 0 0 9的产酶量 ,采用正交试验法确定了较佳培养条件 ,并优化了发酵工艺。工程菌摇瓶产酶稳定在 190U/ml。 2 5L发酵罐产酶亦高达 180U/ml,发酵周期大大缩短 ,仅 9～ 10h。产酶量比原工艺提高 1倍以上 ,具有较好的工业生产前景。

重组L-天冬酰胺酶Ⅱ的中试工艺及其性质的研究

目的 :通过重组L 天冬酰胺酶Ⅱ中试工艺及其性质的研究 ,旨在获得大量的高纯度产品。方法 :采用 5 0 0L发酵罐发酵 ,对所获得菌体进一步提取纯化 ,产品用还原SDS PAGE(十二烷基硫酸钠 聚丙酰胺凝胶电泳法 ) ,HPLC测定纯度 ,质谱和等电聚焦电泳分别测相对分子质量、等电点 ,并进行了紫外扫描。结果 :发酵液产酶活力达到 2 0 0U·mg-1,提取回收率为80 % ,纯化总回收率为 5 7% ,产品比活为 2 2 0U·ml-1,电泳 30 μg上样量显示一条带 ,HPLC测纯度大于 95 %。该酶Mr为13835 6 ,pI为 4.85 ,紫外最大吸收值在 2 78nm处。 结论 :本研究对实现重组L 天冬酰胺酶Ⅱ的工业化生产有重要意义。

甲醛活化壳聚糖制备固定化l-天冬酰胺酶

研究了以甲醛活化的壳聚糖为载体固定化ｌ天冬酰胺酶，其活力回收可达到１１３％，比用以戊二醛为交联剂进行固定化的活力回收要高出五倍多。分别从缓冲液的ｐＨ值及甲醛用量等方面进行了固定化ｌ－天冬酰胺酶的条件优化，并且对固定化酶的性质作了探讨。

定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性,只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。作者通过点突变提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶(Bs AII)的酶活和热稳定性。通过序列比对和同源模拟选择5个点进行突变,构建6个突变菌株。酶活测定结果表明,突变体酶S299N_(ansz)和P348A_(ansz)的酶活较Bs AII分别提高28%和32%。其中P348A_(ansz)的热稳定性和p H稳定性较Bs AII均有明显提高。本研究表明,第299和348位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响,对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础,并提高了该酶的工业应用潜力。

生物降解性聚(羟丙基,丙基)-DL-天冬酰胺高聚物的合成及表征

本文以DL-天冬氨酸为单体缩聚成聚丁二酰亚胺，并用氨基丙醇，丙胺为侧链基，制备了可生物降解性高聚物：聚（羟丙基、丙基）－DL－天冬酰胺。通过核磁共振氢谱，吸水率，特性粘度等方法对所合成的高聚物进行了表征。结果表明：不同摩尔投料比的氨基丙醇和丙胺所制得的高聚物具有不同的性质，因此拓宽了该类高聚物对不同药物的适用性。

桑树天冬酰胺合成酶基因的克隆与表达分析

天冬酰胺合成酶B(asparagine synthetase,AS-B;EC 6.3.5.4)参与植物氮同化过程的催化与调节。在构建的盐胁迫下桑树(Morus L.)抑制消减杂交(SSH)文库中发现一个编码天冬酰胺合成酶的基因片段,采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得2 061 bp的全长序列,完整的开放读码框(ORF)长1 761 bp,编码586个氨基酸,预测蛋白分子质量65.66 kD,将该基因命名为桑树天冬酰胺合成酶基因(MaAS,GenBank登录号:HQ025955)。序列分析显示,MaAS编码的蛋白包括2个保守的功能域(谷氨酰胺-氨基转移结构域和合成酶结构域),与其它植物天冬酰胺合成酶的氨基酸序列相似性在75%以上。将MaAS基因开放读码框连接到pET28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MaAS重组蛋白分子质量大小与预测的分子质量一致。采用邻接法构建的桑树和其它植物基于MaAS蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树、葡萄(Vitis vinif-era)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)聚为一类,亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MaAS基因在桑树不同部位的转录水平存在明显差异,在盛花期的雌花中转录水平最高,尚未木质化的幼根和成熟桑椹中的转录水平较高,幼茎的茎皮和木质部中的转录水平较低,嫩叶中的转录水平很低,腋芽中的转录水平最低。

水溶性高分子材料聚(羟烷基)-天冬酰胺的合成性能及键合药物体内释放研究

以天冬氨酸为单体合成了聚天冬酰胺，用不同长度的羟烷基作为侧链基制成聚－α、β－（羟烷基）－ＤＬ－天冬酰胺。用红外光谱法，差热分析法对材料进行了表征；对材料的急性毒性、稳定性等作了研究，实验表明该类材料为低毒性材料，并有较好的稳定性。以乙酰水杨酸为模型药物，大白兔为实验动物进行体内释放实验，结果证明侧链基越长，释药速率加快。