牛亚科5个群体β-Lg基因PCR-RFLP分析

应用PCR-PFLP技术,分析荷斯坦奶牛、鲁西黄牛、闽南黄牛、渤海黑牛和青海牦牛5个群体741头个体β-乳球蛋白(β-Lg)基因第4外显子和β-Lg 5′侧翼区2个基因座的多态性。结果表明:前4个群体β-Lg A、B基因频率分别为0.4125/0.5875、0.1419/0.8581、0.0333/0.9667和0.1857/0.8143,β-Lg 5′侧翼区A、B基因频率分别为0.412 5/0.5875、0.7286/0.2714、0.7328/0.2672和0.8637/0.1364;牦牛β-Lg B和E基因频率为0.0732/0.9269,未发现其他等位基因。适合性检验表明:β-Lg第4外显子在荷斯坦奶牛、鲁西黄牛和渤海黑牛3个群体中已达Hardy-Weinberg平衡状态,而闽南黄牛未达到平衡状态;β-Lg 5′侧翼区位点荷斯坦奶牛群体接近平衡,其余群体均已达平衡。群体遗传学分析表明:除闽南黄牛β-Lg 5′侧翼区为低度多态外,2个位点在其余群体内均为中度多态,荷斯坦奶牛这2个位点的杂合度和期望杂合度最高,闽南黄牛最低。提示这一研究成果为开展地方遗传资源保护奠定了基础。

水牛β-LG基因3,4外显子遗传特征分析

本文通过PCR产物直接测序法得到水牛β-LG基因第3,4外显子及其旁侧序列后,采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对属于10个群体的224头水牛该基因第4外显子进行了多态性检测,又从中随机抽取属于9个群体的69头水牛采用PCR-SSCP结合测序的方法检测了其第3外显子的遗传多态性。结果显示:河流型水牛和沼泽型水牛β-LG基因的第3外显子均为74 bp;它们的第4外显子均为111 bp;在所研究群体中,两类水牛第3,4外显子序列完全相同,并未发现具有多态现象。与牛科物种同源序列比较显示:水牛β-LG基因3,4外显子在进化上比较保守,相应于普通牛的B等位基因。由于产奶量有明显差异的河流型水牛与沼泽型水牛的β-LG基因第3,4外显子序列间无差异,提示它们对水牛产奶量无直接影响。

奶牛β-Lg基因第1外显子PCR-SSCP多态性与泌乳性能的相关性

采用PCR-SSCP技术并结合测序对233头奶牛β乳球蛋白(β-Lg)基因5’端部分序列和外显子1全部序列进行了多态性研究,分析了该基因与奶牛泌乳性状的相关性。结果表明:β-Lg基因5’端和外显子1共存在2个等位基因3种基因型,BB型为优势基因型,B为优势等位基因。该群体在这一位点上偏离Hardy-Weinberg平衡状态,多态信息含量(PIC)为0.3548。测序结果显示,与普通牛该基因序列(X14710)相比,B等位基因在2073 bp、2202 bp和2206 bp处发生了G→C、C→T和A→G的碱基突变,其中2202 bp处的C→T突变导致第11位氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸,而A等位基因在3个位点上与X14710相同。最小二乘法分析表明,BB型305 d乳蛋白量显著高于AA型和AB型(P<0.05);AB型305 d乳脂量显著高于AA型(P<0.05),BB型与AB型之间差异不显著(P>0.05);等位基因B为高乳蛋白量和乳脂量的优势基因,可作为奶牛选育的分子遗传标记。

EGCG-β-LG纳米粒的制备及体外稳定性研究

通过热诱导法制备EGCG-β-LG纳米粒,并通过单因素实验考察β-LG浓度、EGCG浓度、pH、热激温度对EGCG-β-LG纳米粒包封率的影响。按照优化后的处方配比制备EGCG-β-LG纳米粒,以保护EGCG生物活性,提高EGCG体外稳定性,并测定其包封率、粒径、Zeta电位、体外稳定性及体外释放率。结果表明pH为6.5、热激温度75℃、β-LG浓度3mg/mL、EGCG浓度0.8mg/mL是制备EGCG-β-LG纳米粒的最佳条件。EGCG-β-LG纳米粒包封率为82.61%、粒径为94.46nm、Zeta电位为-27.9mV。EGCG-β-LG纳米粒的EGCG保留率高于EGCG水溶液,其在pH5.5和pH7.4的体外释放率皆低于EGCG水溶液。制备得到的EGCG-β-LG纳米粒体外稳定性较EGCG水溶液有所提高,并有一定的缓释性能。

高效液相色谱-同位素稀释质谱法准确定量牛乳中β-乳球蛋白

β-乳球蛋白(β-LG)是牛乳的主要致敏蛋白之一,亟需开发一种准确且可追溯的准确定量分析方法。本研究利用胰蛋白酶酶解β-LG后,采用同位素稀释质谱(IDMS)法对特定多肽进行定量分析。同时考察氘标记特征多肽IDAL*NENK(D_(6)-Leu)及碳氮双标记特征多肽IDAL*NENK(^(13)C_(6),^(15)N-Leu)作为内标对色谱行为和检测结果的影响,并进行方法学验证。结果表明,本方法的回收率为90.1%~102.7%,变异系数(CVs)<8.0%。分析来自国内市场的5个样本,CVs<6.5%,合成成本较低的氘标记多肽在蛋白质定量中可作为^(13)C、^(15)N标记多肽的可靠替代。本方法抗干扰能力强、灵敏度高、准确度高、重现性好,有助于提高β-LG定量结果在不同实验室之间的可比性。

酪蛋白和乳球蛋白的抗体及酶标物制备研究

选用牛乳中的β-酪蛋白(β-CN)和β-乳球蛋白(β-Lg)为抗原对鸡体免疫,从鸡卵黄中用水稀释法及亲和色谱(HiTrapTM IgY Purification HP)纯化特异性鸡卵黄抗体(IgY)。PAGE电泳分析IgY纯度高达90%,ELISA效价为1:4096。用过碘酸钠氧化法进行抗原的过氧化物酶(HRP)标记,HRP与β-CN和β-Lg的分子个数比分别为1:1和1.5:1的标记效果最好,β-CN-HRP和β-Lg-HRP的效价高达1:640,其ELISA工作浓度分别为1:80和1:40。特异性IgY和酶标抗原为特异检测牛乳蛋白的酶联免疫吸附(ELISA)分析提供必要条件。

EGCG纳米粒的制备及其抗肿瘤活性研究

采用热诱导法制备表没食子儿茶素没食子酸酯-抗坏血酸-β-乳球蛋白纳米粒(EGCG-Vc-β-Lg),考察EGCG与Vc摩尔比对纳米粒粒径、Zeta电位、包埋率、装载量、颜色变化的影响;运用噻唑蓝(MTT)比色法和胞质分裂阻滞微核试验(CBMNT)研究纳米粒对人体黑色素瘤细胞(A-375)、食管癌细胞(TE-1)的增殖抑制作用和初步作用机制。结果表明:EGCG-Vc-β-Lg对A-375、TE-1的增殖抑制有增效作用,并且显著提高了其微核率、凋亡率和坏死率。

羟基自由基氧化体系对乳清蛋白、β-乳球蛋白化学结构的影响

本实验主要研究乳清蛋白(WPI)和β-乳球蛋白(β-Lg)经过FeCl3/抗坏血酸(AsA)/H2O2产生的羟基自由基氧化系统氧化后化学结构产生的变化。两种蛋白分别经过0.1mmol/L或者1mmol/LFeCl3氧化1、5和12h后,总巯基、游离氨都下降,而羰基、二聚酪氨酸和疏水性都呈增加的趋势。低Fe3+浓度氧化1h,WPI巯基含量降低38.5%,β-Lg降低11.6%;而游离氨分别降低20.68%和0.64%。高Fe3+浓度氧化5h,WPI羰基增加32.4%,β-Lg增加8.4%;二聚酪氨酸分别增加132.4%和28%;疏水值增加161.1%和0.7%。高Fe3+浓度带来的氧化效果要比低Fe3+浓度明显(p<0.05)。这说明,氧化改变了蛋白的化学结构,氧化程度取决于浓度Fe3+的浓度,且β-乳球蛋白比乳清蛋白有更好的稳定性。

灌胃不同奶样对BALB/c小鼠致敏性的影响

本试验研究了驼奶、牛奶和人奶对BALB/c小鼠的致敏性强弱,将60只小鼠随机分为5组,每组12只,分别为β-乳球蛋白(β-lg)组(阳性对照组)、牛奶组、驼奶组、人奶组和空白组(阴性对照组),每组分别灌胃1mg/g体重的样品和0.3μg/g体重的霍乱弧菌毒素(CT),空白组灌胃PBS和CT,每周1次。灌胃6周后,通过观察过敏症状,检测血清特异性免疫球蛋白E(IgE)和IgG1、血浆组胺水平及血管通透性等指标,比较几种奶源的致敏性强弱。结果显示,驼奶组、人奶组和空白组小鼠体重正常增长,而β-lg组和牛奶组的体重增长有减慢的趋势。与空白组相比,β-lg组和牛奶组的血清特异性IgE和IgG1水平极显著升高(P<0.01),组胺水平极显著升高(P<0.01),血管通透性增加,过敏症状明显;而驼奶组小鼠血清IgE和IgG1水平极显著低于牛奶组(P<0.01),但与人奶组相比无显著差异(P>0.05),过敏症状轻微,表明驼奶的致敏性明显低于牛奶,且与人奶相似。

牛乳乳清蛋白过敏性研究进展

乳清蛋白是引起牛乳过敏的主要成分,其中,β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)是最主要的过敏原。通过蛋白质改性的方法,可以控制和消除乳清蛋白的过敏性。综述了β-Lg和α-La引起过敏的主要结构片段,并介绍了常用的降低乳清蛋白过敏性的改性方法。

青海柴达木黄牛乳中4种乳蛋白多态性的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对１０６头柴达木黄牛乳汁中４种乳蛋白的多态性进行了研究，结果发现：（１）αＬＡ，β－ＬＧ，αｓ１－ＣＮ和β－ＣＮ都存在多态性；（２）４种乳蛋白的平均有效等位基因数为１．３７５个，平均基因杂合度为０．２３３ ４，平均基因均质指数为０．６０７２；（３）在β－ＬＧ基因座上发现罕见等位基因 β－ＬＧＤ，在β－ＣＮ基因座上发现新等位基因在β－ＣＮＦ。

5个山羊品种β-1g5′侧翼区多态性研究

利用PCR-RFLP技术对西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊等5个品种162个个体的β-lg5′侧翼区进行了多态性分析。结果表明,PCR扩增产物大小为710bp,被Sma 酶消化后表现多态性。西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊的A/B等位基因频率分别为0.911/0.089,0.871/0.129,1.000/0.000,0.933/0.067,0.944/0.056,且它们的基因杂合度/有效等位基因数/Shaanon信息熵/PIC值分别为0.163/1.194/0.301/0.150,0.225/1.290/0.385/0.200,0.000/1.000/0.000/0.000,0.125/1.142/0.245/0.117,0.105/1.117/0.215/0.100。由此可见,关中奶山羊的遗传多态性最丰富,其次是西农萨能奶山羊,而安哥拉山羊和波尔山羊的遗传多态性较低,陕南白山羊未表现出多态性。

响应面法优化β-乳球蛋白粗提物自组装V_E的工艺条件

为了优化β-乳球蛋白粗提物自组装VE工艺条件,通过单因素实验研究了β-Lg粗提物与VE质量比例、磁力作用时间、热激温度对β-Lg-VE结合工艺的影响。在单因素实验基础上,利用Design Expert.V8.0.6.1软件,设计了3因素、3水平的Box-Behnken中心组合实验,进行响应面法分析,优选β-乳球蛋白粗提物自组装VE工艺条件。结果表明,β-Lg粗提物自组装VE的最佳工艺条件:β-Lg粗提物与VE质量比例为19∶1,磁力作用时间49 min,热激温度为72℃。此条件下,β-Lg-VE的结合率为(68.5±0.98)%,与理论值68.98%拟合性较好。β-Lg-VE自组装分子的溶解性较好,其在食品工业中具有广泛应用。

人促红细胞生成素在转基因小鼠乳汁中表达

将山羊的β乳球蛋白启动子连接人促红细胞生成素基因，构建转基因表达载体。通过显微注射的方法转基因小鼠。经ＰＣＲ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测验证，获得４只转基因阳性小鼠，其中３只母鼠哺乳期收集乳汁，经ＥｐｏＥＬＩＳＡ检测为阳性。对４组转基因阳性小鼠的部分子代母鼠，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，又鉴定出６只获得遗传的阳性Ｇ１代母鼠以ＤｏｔＥＬＩＳＡ的方法检测，其中两只Ｇ１代母鼠乳汁中的Ｅｐｏ含量为０５μｇ／ｍＬ。实验证实，８６７ｂｐ的β乳球蛋白启动子可以指导人促红细胞生成素在小鼠乳汁中表达。

去折叠态β-乳球蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯的相互作用

通过微波处理β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)得到去折叠态β-乳球蛋白(unfolded-β-lactoglobulin,U-β-LG),采用荧光光谱、紫外-可见光谱、圆二色光谱的方法研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)与U-β-LG的相互作用机制。结果表明,EGCG能与β-LG和U-β-LG相互作用形成复合物。它们相互之间均主要为疏水作用力。在298 K时,EGCG与β-LG和U-β-LG的结合距离分别为3.188 nm和2.875 nm。EGCG的结合使β-LG和U-β-LG的二、三级结构发生变化,表面疏水性降低。与天然β-LG相比,U-β-LG与EGCG具有更大的结合强度,结合后的U-β-LG发生更大的结构变化。

β-乳球蛋白与黑米花色苷的相互作用

从荧光光谱、同步荧光光谱、紫外-可见光谱、抗氧化能力和分子对接等方面,研究黑米花色苷(black rice anthocyanin,BRA)与β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)在模拟生理条件下的相互作用。结果显示,BRA对β-LG具有较强的荧光猝灭,猝灭方式为静态猝灭,说明二者发生相互结合,同时计算了结合位点数和结合常数,热力学参数表明疏水作用力为其主要的作用力;根据非辐射能量转移理论,结合距离r为3.14 nm。同步荧光光谱结果显示,BRA与β-LG的相互作用影响乳球蛋白的构象,但不影响色氨酸和酪氨酸的微环境;分子对接结果显示BRA中的主要成分矢车菊-3-O-葡萄糖苷与β-LG的结合主要是疏水作用力,该结果与热力学参数分析结果相一致。

动态高压微射流协同糖基化处理对β-乳球蛋白热稳定性和结构的影响

采用动态高压微射流(dynamic high pressure microfluidization,DHPM)协同葡聚糖糖基化处理对β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)进行改性,研究其热稳定性和结构的变化。结果表明,β-Lg的峰顶温度为73. 48℃,经DHPM不同压力(40、80、120 MPa)处理后,其热稳定性先下降后上升,但经DHPM协同糖基化处理后,其热稳定性均呈上升趋势。理化分析结果显示,80 MPa DHPM协同糖基化处理的β-Lg具有最低的游离氨基酸含量(2. 20 mg/m L)和最高的褐变程度(A294=1. 092,A420=0. 062),说明DHPM预处理可以促进β-Lg-葡聚糖的糖基化反应,且80 MPa为最佳处理压力。结构分析表明,DHPM处理可明显提高β-Lg的表面疏水性和自由巯基含量,降低其内源荧光强度,使其发生二级结构变化。经DHPM协同糖基化处理后,β-Lg的表面疏水性有所降低,但仍高于天然β-Lg的表面疏水;自由巯基含量呈现先降低后升高趋势,在80 MPa时明显高于天然β-Lg,内源荧光强度随着压力的增加呈先降低后上升的趋势,但均明显低于天然β-Lg的内源荧光强度。因此,DHPM 80 MPa预处理样品具有最高的热稳定性和糖基化程度,且β-Lg的糖基化程度越高,其热稳定性越好。

奶牛β-乳球蛋白研究进展

β-乳球蛋白（β-Lg）是由乳腺上皮细胞合成分泌的一种特有乳清蛋白,是鲜奶中蛋白质的一种,占鲜奶蛋白质的7%~12%,是牛和其他反刍动物乳中乳清蛋白的重要组分,其功能目前尚不明确。研究已确定β-乳球蛋白在牛乳中存在多种遗传变构体,不同变构体对奶牛牛乳的组分、性质和产量有一定的影响。单核苷酸多态性（SNP,Single nucleotide polymorphism）主要是指基因组DNA某一特定核苷酸的改变（转换、颠换、插入或缺失）引起的点突变,使得群体之间和个体之间产生了差异,已被广泛应用于医学、遗传学、动植物育种等领域。利用β-乳球蛋白多态性与产奶性能在基因上的连锁关系,将乳蛋白基因作为生化标记应用到辅助育种中,可改进畜群的遗传素质,提高生产性能。

不同时段嗜酸乳杆菌干预对β-乳球蛋白过敏缓解的作用

目的:分析和比较嗜酸乳杆菌预防和治疗β-乳球蛋白过敏的作用和效果,为抗过敏性能益生菌的使用提供科学依据。方法:BALB/c小鼠随机分为空白组、β-乳球蛋白过敏组、嗜酸乳杆菌预防组和嗜酸乳杆菌治疗组。建模结束后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠血清中IgE及Thl/Th2型细胞因子(IL-12、IFN-γ、IL-4)的含量;RT-PCR法检测脾脏中T-bet和GATA-3 mRNA的表达量。结果:嗜酸乳杆菌干预可有效缓解β-乳球蛋白过敏,与过敏组小鼠比较,其血清总IgE和特异性IgE水平明显降低(P<0.05),IFN-γ、IL-12含量及T-bet mRNA表达量显著增加,IL-4含量及GATA-3 mRNA表达显著降低(P<0.05)。特别是嗜酸乳杆菌预防组的抗过敏效果优于治疗组,且预防组调节IFN-γ/IL-4比值(代表Thl/Th2细胞平衡)的能力显著优于治疗组(P<0.05)。结论:嗜酸乳杆菌预防β-乳球蛋白过敏的效果优于其治疗效果。

药效活性BVOCs物质组与β-牛乳球蛋白选择性结合的分子机制

顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用技术(headspace-solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS)用于分析植物柚皮活性挥发物(botany volatile organic compounds,BVOCs)物质组与β-牛乳球蛋白(bovineβ-lactoglobulin,β-LG)相互作用,筛选出药效活性BVOCs物质组。通过定量回收BVOCs的方法,分析β-LG与药效活性BVOCs物质组的选择结合作用,计算结合参数。进而结合分子对接及光谱法建立BVOCs与β-LG结合的分子模型,探讨组学角度下药效活性BVOCs物质组与β-LG的分子作用机制。结果表明,HS-SPME/GC-MS技术能够通过β-LG与BVOCs物质组的结合作用,筛选出药效活性BVOCs物质组D-柠檬烯(dipentene,Dt)、乙酸芳樟酯(linalylacetate,La)及圆柚酮(nootkatone,Nt)。参数计算表明,β-LG与Nt的亲和力最强,但结合力不强,对La的亲和力最弱。β-LG对Dt的亲和力较弱,但结合力最强,结合率达54.66%,说明β-LG与药效活性BVOCs物质组的选择结合强度取决于BVOCs分子的化学结构特性,β-LG更倾向结合含有羰基氧结构的醛酮类BVOCs分子。本文还建立了药效活性BVOCs物质组与β-LG的分子模型,评估了BVOCs物质组(Dt,La,Nt)在β-LG分子上的结合位置。并阐明了药效活性BVOCs物质组导入后引起的β-LG二级结构的松动、伸展及构象改变是范德华力、疏水作用和氢键共同作用的结果。本研究为从BVOCs物质组角度筛选药效活性BVOCs物质组提供新方法,并为从组学角度考察药效活性BVOCs物质组与功能蛋白质分子的结合机制提供有益参考。