朱砂叶螨β-N-乙酰己糖胺酶基因TecHEX3的克隆及在蜕皮发育中的作用

【目的】本研究旨在探明朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质降解通路中的关键酶β-N-乙酰己糖胺酶基因(TecHEX3)在螨蜕皮发育中的功能,为开发新型安全的防治害螨生物农药奠定基础。【方法】利用PCR克隆朱砂叶螨TecHEX3,并进行生物信息学分析。利用RT-qPCR检测TecHEX3在朱砂叶螨不同发育阶段(卵、幼螨、若螨和成螨)以及饲喂蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)的若螨中的表达量。通过饲喂法进行朱砂叶螨雌成螨和若螨TecHEX3的RNAi,分析沉默效率,统计并观察朱砂叶螨若螨的死亡率和致死表型。【结果】成功克隆了朱砂叶螨TecHEX3(GenBank登录号:OR413561),其编码蛋白具有典型的20糖苷水解酶家族结构特征;系统发育树表明TecHEX3与二斑叶螨T.urticae TuHEX3的亲缘性最高且均属于β-N-乙酰己糖胺酶Ⅳ型。TecHEX3在朱砂叶螨不同发育阶段都有表达,在成螨期表达量最高;饲喂500 ng/μL的20E对TecHEX3的表达有最好的诱导效果。RNAi结果表明饲喂ds TecHEX3时朱砂叶螨若螨TecHEX3表达量较对照组(饲喂ds EGFP)显著下调81%;沉默TecHEX3导致朱砂叶螨蜕皮困难或蜕皮后形态异常,致死率达40.58%。【结论】TecHEX3参与朱砂叶螨几丁质降解过程,并在朱砂叶螨的蜕皮发育过程中发挥重要作用。

昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶研究进展

糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶是N-乙酰己糖胺代谢过程中一个重要的酶,其可将位于非还原端以β糖苷键连接的N-乙酰己糖胺从寡糖及糖复合物中水解下来。昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰已糖胺酶参与昆虫多个生理过程,包括表皮几丁质水解、蛋白质N糖基化修饰、糖复合物水解及精卵识别,因此可能成为生态农药设计的潜在靶标,受到国内外学者的普遍关注。根据昆虫20家族β-N-乙酰己糖胺酶的进化关系和生理功能,可以将其分为4个亚家族,分别为Hex1、Hex2、Hex3和Hex4。Hex1主要在昆虫蜕皮时期的表皮中表达,RNA干扰该基因能够导致昆虫在发育过程中不能正常蜕皮而死亡。通过酶学性质研究发现,Hex1能够专一性水解以β1-4糖苷键连接的几丁质寡糖底物,而不能水解以其他形式连接的底物,是专一性的参与几丁质水解的β-N-乙酰己糖胺酶。目前获得的唯一一个昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的晶体结构来自于亚洲玉米螟的OfHex1,其参与底物结合的"+1"位点存在一个特殊的三明治结构,使得Hex1对几丁质寡糖具有高度的选择性和水解活性。Hex2在双翅目昆虫中并不存在,与人类的β-N-乙酰己糖胺酶具有高度的相似性,RNA干扰该基因的表达能够导致幼虫化蛹时异常,成虫翅、附肢、触角等异常。通过酶学性质研究表明,Hex2能够水解释放几丁质寡糖,糖复合物等底物中的β-N-乙酰己糖胺,具有广泛的底物谱。Hex2的功能可能与人类Hex酶的功能类似,参与糖复合物的水解。Hex3是目前研究较少的一类β-N-乙酰己糖胺酶,RNA干扰该基因的表达能够导致幼虫蜕皮过程异常。Hex3存在于昆虫蜕皮液中,与Hex1存在相互作用,可能形成二聚体。通过酶学性质研究表明,Hex3能够水解几丁质寡糖底物,但活性较弱,说明其可能参与几丁质的水解。此外,Hex3、Hex1和Hex4被发现存在于双翅目昆虫精子的表面,可能参与精卵识别过程。Hex4又被称为FDL,是因为该基因的缺失能够导致果蝇左右大脑发生融合(fused lobe)。它是另外一种具有严格底物选择性的β-N-乙酰已糖胺酶,能够专一性地水解糖复合物GnGn中α1-3分支上以β1-2糖苷键连接的G1cNAcβ1-2Man,通过细胞定位研究表明Hex4主要存在于高尔基体当中。以上表明Hex4的主要功能是参与细胞内的糖基化修饰过程。尽管目前对于昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的研究取得了很大的进展。对Hex1的功能、酶学性质和晶体结构研究得较为透彻,对于设计环境友好的杀虫剂具有较强的指导意义。但其他3种β-N-乙酰己糖胺酶在生理条件下如何发挥功能,以及4种β-N-乙酰己糖胺酶活性差异的结构基础并不是十分清楚。作者从进化关系、晶体结构、酶学性质和生理功能等方面对昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶的研究进展进行综述。

含氟N,N'-二芳基异硫脲的合成及昆虫β-N-乙酰己糖胺酶抑制活性研究

β-N-乙酰己糖胺酶是几丁质代谢过程中一种重要的酶,已被确定为医药和农药的潜在靶标。本文合成了16个未见文献报道的含氟N,N'-二芳基异硫脲,并测定了对β-N-乙酰己糖胺酶OfHex1和OfHex2的抑制活性,酶活性测试表明对OfHex2显示出一定的抑制效果。

通过RNA干扰研究亚洲玉米螟乙酰己糖胺酶的潜在靶标性

溶酶体β-N-乙酰己糖胺酶(EC 3.2.1.52)催化水解糖复合物,释放单分子乙酰己糖胺,在昆虫生长发育过程中发挥重要作用。OfHEX2基因(GenBank登陆号为EF469203)是已从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)5龄幼虫体内获得的基因,其编码产物是β-N-乙酰己糖胺酶OfHex2。为考察OfHex2能否成为农药设计的分子靶标,研究了RNA干扰沉默OfHEX2基因对亚洲玉米螟生长发育的影响,同时探索了小分子抑制剂2-乙酰氨基-1,2-二脱氧野尻霉素(2-acetamido-1,2-dideoxynojirimycin,2-ADN)和咪唑对OfHex2的体外抑制效果。结果表明:向5龄第1天的亚洲玉米螟幼虫注射dsOfHEX2,能够显著干扰OfHEX2基因在幼虫期的正常表达,但不能干扰其在蛹期的表达;RNA干扰导致OfHEX2基因在亚洲玉米螟5龄第3天幼虫中的表达水平仅为对照组的7.1%,并导致预蛹的腹部无法正常收缩,蛹和成虫的附件发育畸形,其中15%畸形蛹因发育不正常而死亡。研究结果表明,OfHex2在昆虫发育中具有重要的生理意义,其功能缺失具有致畸和间接致死效果,因此可能成为新型农药设计的潜在靶标。抑制作用研究结果表明,小分子2-ADN是OfHex2的竞争性抑制剂,酶活力抑制常数Ki值为0.94±0.035μmol/L。

海洋细菌假交替单胞菌DL-6来源β-N-乙酰己糖胺酶异源表达及酶学表征

从海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DL-6中克隆β-N-乙酰己糖胺酶基因(PsHex),扩增至pET-28a(+),并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,经镍-次氮基三乙酸亲和层析纯化得到纯蛋白。结果表明:PsHex编码876个氨基酸,分子质量约99.46 kDa,理论等电点5.65,序列对比分析表明,Ps Hex属于糖苷水解酶GH20家族;Ps Hex蛋白最适温度30℃,最适pH 8.5,比活力11.30 U/mg,且在20℃、pH 7.5时稳定性最高;重组蛋白可降解琼脂、葡聚糖、可溶性淀粉、卡拉胶等多种底物;Na^(+)、Mg^(2+)、Fe^(3+)、K^(+)、Ca^(2+)、二硫苏糖醇、吐温-80、乙二胺四乙酸、β-巯基乙醇对酶有激活作用;Ps Hex以对硝基苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷为底物的米氏常数(K_(m))为2.523 mol/L、转化效率(K_(cat))为79.035 min^(-1)、最大反应速率(v_(max))为2.081 U/mg、K_(cat)/K_(m)=31.326。该研究为酶法降解几丁质产生N-乙酰葡萄糖胺的生产应用提供了理论参考。

双酶协同降解胶体几丁质及其作用机制

建立一种几丁质酶(chitinase,ChiA)和β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N协同催化体系,可实现一步反应降解胶体几丁质制备N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc),探讨不同因素对双酶协同催化体系的影响和双酶协同作用机制。结果表明,双酶协同催化体系的最适反应温度为30℃,最适反应pH值为6,ChiA与HJ5N添加比(加酶量(U)计)为2∶1。在最优反应条件下以90 g/L虾壳几丁质(胶体几丁质30.3 g/L)为底物时,GlcNAc产量为17.55 mg/mL,收率达到58%。ChiA与HJ5N的协同作用机制主要表现在HJ5N可保证中间产物几丁二糖(GlcNAc)_(2)快速被转化为GlcNAc,有效解除(GlcNAc)_(2)对ChiA的抑制作用,从而实现双酶协同高效催化降解胶体几丁质制备GlcNAc。这为酶法降解胶体几丁质制备GlcNAc的工业应用提供了一种有效策略。

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmHEX基因的分子克隆及表达分析

β-N-乙酰-己糖胺酶（beta-N-acetylhexosaminidase/beta-Hexosaminidase,HEX）是一种糖苷水解酶,在几丁质降解、N-糖基化修饰、糖复合物代谢等过程发挥重要作用。为了探究PmHEX在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究利用RACE技术克隆获得马氏珠母贝PmHEX（Pinctada fucata martensii HEX,PmHEX）cDNA全长序列并通过qRT-PCR检测其在不同组织的表达模式。结果表明,PmHEX序列全长3 812 bp,其中5＇UTR为22 bp,3＇UTR为364 bp,开放阅读框（ORF）为3 426 bp,编码1 141个氨基酸;预测其相对分子量为125.92 kD,理论等电点为9.06;SMART软件分析PmHEX蛋白质序列,发现它具有典型的GH20和GH20b结构域和一个碳水化合物结合结构域;多序列比对显示PmHEX与其它物种的HEX具有较高的保守性,与珠母贝HEX序列相似度高达54%;q RT-PCR表达分析显示PmHEX在外套膜各区表达量较高,且在边缘区的表达量显著高于其他组织。综上所述,PmHEX可能参与马氏珠母贝贝壳的形成过程。

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmHEXL基因的分子特征与表达分析

几丁质作为有机框架主要成分参与贝壳的形成。β-N-乙酰-己糖胺酶(Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase, HEX)属于糖苷水解酶家族20,在几丁质水解过程发挥重要作用。为了探究Pm HEXL在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究利用RACE技术克隆获得Pm HEXL基因c DNA全长序列并检测其在不同组织的表达模式。研究显示,Pm HEXL基因序列全长2 760 bp,其中5'UTR为167 bp,3'UTR为268 bp,开放阅读框(ORF)为2 325 bp,编码774个氨基酸;预测其相对分子量为89.59 kD,理论等电点为5.93;SMART软件分析PmHEXL蛋白质序列,发现它具有典型的GH20、GH20b结构域和CHB-HEX结构域;多序列比对结果显示Pm HEXL与其它物种的HEX具有较高的保守性;qPCR表达分析显示Pm HEXL在外套膜套膜区表达量最高,边缘区次之。综上所述,Pm HEXL可能参与马氏珠母贝贝壳的形成过程。

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmHEX基因的功能研究

几丁质是软体动物贝壳有机框架的重要成分,其代谢在贝壳矿化中发挥重要作用。β-N-乙酰-己糖胺酶(HEX, EC3.2.1.52)是几丁质代谢的关键水解酶。为了探究马氏珠母贝β-N-乙酰-己糖胺酶(Pm HEX)(登录号:MF555152)在贝壳形成中的作用,本研究利用原位杂交(ISH)技术检测Pm HEX基因在外套膜的定位,结果显示Pm HEX的mRNA主要分布于外侧褶的外上皮细胞、中褶的内侧上皮细胞和内褶上皮细胞。利用RNAi技术抑制Pm HEX表达后,Pm HEX在边缘区和套膜区的表达量均显著下调;SEM观察发现实验组的棱柱层和珍珠层的微观结构都出现不同程度的紊乱。综上所述,Pm HEX可能通过影响几丁质代谢,参与马氏珠母贝贝壳棱柱层和珍珠层的矿化过程。