小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用

目的 研究小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶（NagZ）的调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用.方法 通过对小肠结肠炎耶尔森菌3个AmpD蛋白同系物（AmpD1～3）基因（ampD1～3）、低分子量青霉素结合蛋白（LMM PBPs）基因（pbp4、pbp5a、pbp5b、pbp7）、NagZ基因（nagZ）以及ampR基因进行敲除或回补,以构建基因突变株,并利用头孢西丁对突变株进行诱导;采用检测头孢硝噻吩水解法测定诱导组和非诱导组突变株AmpCβ-内酰胺酶活性（单位为U）,采用luxCDABEreporter系统检测AmpCβ-内酰胺酶启动子活性[单位为相对光单位（RLU）],采用对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为显色底物测定NagZ酶活性（单位nmol/L）.结果 AmpD1蛋白的功能较强,YEΔD1突变株的AmpCβ-内酰胺酶表达量出现上升,诱导组和非诱导组分别为（3.29±1.58）和（4.08±1.75）U.YEΔ5b、YEΔ4Δ5b、YEΔ5aΔ5b和YEΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性增强,其中YEΔ4Δ5b突变株活性最高,诱导组和非诱导组分别为（106903.16±61910.61）和（205427.45±45352.17）RLU.缺失3种基因的菌株中,YEΔ4Δ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（304108.04±99274.53）和（531440.21±68891.02）RLU;缺失4种基因的菌株中,YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（1013810.99±260955.96）和（1230214.59±205526.79）RLU;敲除nagZ基因后,YEΔD1D2D3ΔZ突变株AmpCβ-内酰胺酶活性未发生明显的变化,而YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ突变株活性下降明显,诱导组和非诱导组分别为（0.30±0.20）和（0.29±0.21）U,基本降至野生株水平.结论 在肠杆菌科细菌中发现多个AmpD蛋白参与ampC基因的三级调控机制;发现以PBP5b为主,PBP4、PBP5a和PBP7共同参与的ampC基因调控模式;同时还证实了在小肠结肠炎耶尔森菌具有NagZ依赖和非依赖两种ampC基因调控途径.

昆虫激素对家蚕不同组织β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性的影响

【目的】研究蜕皮激素20E和保幼激素JH处理对家蚕5龄幼虫不同组织β-N-乙酰葡萄糖苷酶(β-N-acetylgucosaminidase,GlcNAcases)活性的影响,为深入解析家蚕GlcNAcases的生物学功能提供参考。【方法】利用微量注射器注射蜕皮激素20E和保幼激素JH,分别测定6、12、18、24和48 h家蚕幼虫血淋巴、脂肪体、中肠、表皮和丝腺中GlcNAcases的活性变化情况。【结果】在JH处理组,家蚕幼虫血淋巴GlcNAcases活性在12 h便开始显著增高,在18、24和48 h持续极显著高于对照组;在20E处理组,血淋巴GlcNAcases活性仅在24和48 h显著高于对照组。对于20E处理组和JH处理组,脂肪体组织GlcNAcases的活性变化情况相似,在6、12和18 h酶活性无显著变化,在24和48 h极显著高于对照组。经20E或JH处理后,中肠组织GlcNAcases活性在6和12 h均略高于对照组,但与对照组相比差异不显著;在18 h开始显著高于对照组,在24 h极显著高于对照组,随后在48 h酶活性降低至对照组水平。20E处理后,表皮GlcNAcases活性在12 h开始显著高于对照组,在18和24 h持续显著高于对照组,48 h酶活性降低至对照组水平。JH处理后,表皮组织GlcNAcases活性在12、18和24 h极显著低于对照组,在48 h恢复至对照组水平。丝腺组织中的GlcNAcases活性在20E处理12 h开始高于对照组,但差异不显著,随后酶活性持续增强,在18和24 h极显著高于对照组;在48 h有所降低,但仍显著高于对照组。JH处理12 h GlcNAcases活性开始降低,但与对照组相比差异不显著,18 h开始显著低于对照组,24和48 h持续极显著低于对照组。【结论】蜕皮激素20E和保幼激素JH对家蚕幼虫血淋巴、脂肪体和中肠中GlcNAcases活性具有一定的激活作用。在表皮和丝腺组织中,20E能促进并激活GlcNAcases的活性,而JH则抑制其的活性。这提示GlcNAcases在家蚕幼虫不同组织发挥的功能并不完全相同,并且不同激素对GlcNAcases活性的影响效果亦存在差异。

BmNPV侵染对家蚕β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性及其相关基因转录水平的影响

为了深入解析β-N-乙酰葡萄糖苷酶(GlcNAcases)在病毒感染过程中的作用机制,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)经口感染5龄起家蚕,在感染后3、6、9、12、24 h提取家蚕血淋巴、脂肪体和中肠,采用荧光定量PCR方法检测GlcNAcases基因的表达水平,同时利用GlcNAcases测试盒测定GlcNAcases活性变化情况。结果显示,经口感染BmNPV后,家蚕血淋巴、脂肪体和中肠组织中GlcNAcases活性整体呈现先逐渐升高后急剧降低的趋势;而家蚕机体4个GlcNAcases编码基因的转录水平在不同组织中存在一定差异。在感染BmNPV后3~12 h,血淋巴中BmGlcNAcase1和BmGlcNAcase2的表达量均明显上调,BmGlcNAcase3和BmGlcNAcase4表达量与对照组(未感染)无差异;在感染后24 h,血淋巴中4个GlcNAcases基因表达量均开始下调,且表达量明显低于对照组。脂肪体组织中BmGlcNAcase2和BmGlcNAcase3在感染BmNPV后其表达量呈现先上调后下调的趋势,其中BmGlcNAcase2的表达量在感染BmNPV后3 h就开始上调,BmGlcNAcase3的表达量在9 h才开始上调,BmGlcNAcase1和BmGlcNAcase4的表达量无明显变化。感染BmNPV后,中肠BmGlcNAcase2和BmGlcNAcase4的表达量整体先逐渐上调,增高至一个峰值,随后急剧减弱,表达受到明显抑制;而BmGlcNAcase1和BmGlcNAcase3在感染BmNPV后其表达量呈现下调趋势,表达量逐渐降低。综上,BmGlcNAcase2编码的GlcNAcases在家蚕抵御BmNPV的侵染过程中发挥了一定的免疫防御功能。

蛋白质O-连接-N-乙酰葡萄糖胺修饰在心力衰竭中的作用的研究进展

蛋白质O-连接-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰是细胞内普遍存在的重要蛋白质翻译后修饰,对于细胞生物学功能至关重要。这种翻译后修饰可影响细胞的翻译与转运,对维持和促进正常细胞发挥功能有重要意义。蛋白质O-GlcNAc修饰对心脏组织有重要作用,短期内增加的蛋白质O-GlcNAc对心脏有保护作用,而长期增加的蛋白质O-GlcNAc导致心脏功能障碍。蛋白质O-GlcNAc修饰在心血管疾病中的辅助治疗作用已成为当前研究热点。现就蛋白质O-GlcNAc修饰在心力衰竭中的作用的研究进展进行综述。

海洋细菌假交替单胞菌DL-6来源β-N-乙酰己糖胺酶异源表达及酶学表征

从海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DL-6中克隆β-N-乙酰己糖胺酶基因(PsHex),扩增至pET-28a(+),并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,经镍-次氮基三乙酸亲和层析纯化得到纯蛋白。结果表明:PsHex编码876个氨基酸,分子质量约99.46 kDa,理论等电点5.65,序列对比分析表明,Ps Hex属于糖苷水解酶GH20家族;Ps Hex蛋白最适温度30℃,最适pH 8.5,比活力11.30 U/mg,且在20℃、pH 7.5时稳定性最高;重组蛋白可降解琼脂、葡聚糖、可溶性淀粉、卡拉胶等多种底物;Na^(+)、Mg^(2+)、Fe^(3+)、K^(+)、Ca^(2+)、二硫苏糖醇、吐温-80、乙二胺四乙酸、β-巯基乙醇对酶有激活作用;Ps Hex以对硝基苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷为底物的米氏常数(K_(m))为2.523 mol/L、转化效率(K_(cat))为79.035 min^(-1)、最大反应速率(v_(max))为2.081 U/mg、K_(cat)/K_(m)=31.326。该研究为酶法降解几丁质产生N-乙酰葡萄糖胺的生产应用提供了理论参考。

飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析

【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析,探究该酶在飞蝗(Locusta migratoria)生长发育过程中的生物学功能,为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据Lm NAG1的cDNA全长序列(Gen Bank:JX888720.1)设计包含酶切位点Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段,双酶切后连接至pFast Bac^(TM)-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上,用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带,挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid,Bacmid)。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9中,72 h内连续观察细胞形态,当出现感染迹象后收集细胞,离心,取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞,裂解并提取蛋白,Western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞,提取蛋白,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化,取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFast Bac-LmNAG1重组质粒,酶切验证与目标条带一致。将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,PCR扩增挑选出纯白斑,成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上。将重组Bacmid转染至Sf9细胞,72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大,边缘不规则等感染迹象。离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞,72 h后收集细胞,Western blot检测发现在67 kD附近有明显条带,与LmNAG1的理论分子量一致,获得带6×His标签的融合蛋白。大量感染收集细胞提取蛋白,经Ni-NTA琼脂糖层析纯化,进一步透析除盐后用阴离子交换柱Q二次纯化,得到了高纯度的目的蛋白。用Bradford法测定最纯的E3组分的蛋白浓度为0.057μg·μL^(-1)。体外活性测定结果表明LmNAG1的最适pH为8.0,且在pH 6.0—8.0范围内具有较高的稳定性;LmNAG1的最适温度为40℃,在40℃以下具有很高的稳定性,当温度高于45℃时热稳定性迅速下降;采用4MU-GlcNAc为底物测得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷键的活性,可以释放出4MU,它的动力学参数K_m值为(0.28±0.02)mmol·L^(-1),K_(cat)值为(902.88±38.15)s^(-1)。【结论】成功获得高纯度且具活性的LmNAG1蛋白,其可水解β-1,4糖苷键连接的几丁质寡糖,与已知昆虫NAG1具有相似的生物学功能,即参与几丁质的降解。

飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的特性及生物学功能

【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA)的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1天至第7天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a(+)蛋白表达载体,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋白的酶学活性;通过RNA干扰研究GNA的生物学功能。【结果】飞蝗GNA与其它物种GNA的氨基酸序列一致性很高,结合底物GlcN6P的氨基酸残基完全一致,说明不同物种间GNA非常保守;飞蝗GNA组织特异性分析显示其在表皮、脂肪体及肌肉中表达量较高;飞蝗5龄表皮的发育变化表明,GNA在刚蜕皮后的表达量最高,之后逐步降低;飞蝗GNA重组蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中成功表达,经过Ni-NTA柱纯化得到单一目的条带,酶学特性研究表明飞蝗GNA重组蛋白的最适反应温度为37—50℃,最适pH为8.0—9.5;测定了飞蝗重组GNA的Km值,当D-GlcN6P的浓度为200μmol.L-1时,Acetyl-CoA的Km=133.60μmol.L-1;当Acetyl-CoA的浓度为200μmol.L-1时,D-GlcN6P的Km=42.43μmol.L-1;飞蝗GNA的RNA干扰结果显示,GNA的表达能够被有效沉默,但蜕皮及发育未受影响。【结论】飞蝗GNA与其它物种的GNA氨基酸序列一致性很高;用该序列原核表达的重组蛋白具有葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的活性;飞蝗GNA被干扰后未观察到对飞蝗蜕皮及发育产生影响,推测存在N-乙酰葡萄糖胺激酶(GlcNAc kinase)补救途径催化产生GNA的底物N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc6P),用于几丁质的合成。

太平洋白对虾(Penaeus vannamei)β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶液中的失活动力学(英文)

应用动力学方法研究了太平洋白对虾(Penaeusvannamei)β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶液中以pNP-β-D-GlcNAc为底物时酶活力的变化规律.表明酶在DMSO浓度低于4.20mol/L,酶的失活过程是可逆的,DMSO并不造成酶绝对量的减少,仅对酶的活力发生可逆的下降.测得DMSO对酶抑制的IC50为1.2mol/L.观测了在不同底物浓度下NAGase在0、0.35、0.70、1.05、1.40、1.75mol/L的DMSO溶液中的失活过程,分别测定了游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)的微观失活速度常数k+0和k′+0比较结果(k+0值远远大于k′+0)表明,在DMSO溶液中游离酶比酶-底物络合物更易失活,即底物的存在对于酶被DMSO的失活具有明显的保护作用.随着DMSO浓度的增加,游离酶的逆向微观复活速度常数k-0却不断降低,说明在高浓度DMSO环境中,NAGase可逆恢复的能力逐渐微弱.

朱砂叶螨β-N-乙酰己糖胺酶基因TecHEX3的克隆及在蜕皮发育中的作用

【目的】本研究旨在探明朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质降解通路中的关键酶β-N-乙酰己糖胺酶基因(TecHEX3)在螨蜕皮发育中的功能,为开发新型安全的防治害螨生物农药奠定基础。【方法】利用PCR克隆朱砂叶螨TecHEX3,并进行生物信息学分析。利用RT-qPCR检测TecHEX3在朱砂叶螨不同发育阶段(卵、幼螨、若螨和成螨)以及饲喂蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)的若螨中的表达量。通过饲喂法进行朱砂叶螨雌成螨和若螨TecHEX3的RNAi,分析沉默效率,统计并观察朱砂叶螨若螨的死亡率和致死表型。【结果】成功克隆了朱砂叶螨TecHEX3(GenBank登录号:OR413561),其编码蛋白具有典型的20糖苷水解酶家族结构特征;系统发育树表明TecHEX3与二斑叶螨T.urticae TuHEX3的亲缘性最高且均属于β-N-乙酰己糖胺酶Ⅳ型。TecHEX3在朱砂叶螨不同发育阶段都有表达,在成螨期表达量最高;饲喂500 ng/μL的20E对TecHEX3的表达有最好的诱导效果。RNAi结果表明饲喂ds TecHEX3时朱砂叶螨若螨TecHEX3表达量较对照组(饲喂ds EGFP)显著下调81%;沉默TecHEX3导致朱砂叶螨蜕皮困难或蜕皮后形态异常,致死率达40.58%。【结论】TecHEX3参与朱砂叶螨几丁质降解过程,并在朱砂叶螨的蜕皮发育过程中发挥重要作用。

Clostridium paraputrificum M-21β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的表达、纯化与性质

以ClostridiumparaputrificumM21染色体DNA为模板,经PCR扩增获得编码β N 乙酰氨基葡萄糖苷酶的基因nag3A,与质粒pQE30T所构建的表达质粒pNAG3A在EscherichiacoliM15中表达良好.从重组E.coliM15中纯化得到的Nag3A以4 MU GlcNAc为底物时,最适作用温度和最适作用pH分别为50℃和7.0;在30℃以下和pH6～9之间该酶活性稳定.对4 MU GlcNAc的Km和Vmax分别为7.9μmol和21.8μmol/(min·mg).Nag3A可以水解几丁寡糖和几丁质,作用方式是从非还原端逐一水解β 1,4 D N 乙酰氨基葡萄糖苷键,产生N 乙酰氨基葡萄糖,对几丁二糖具有较高的水解活性.

八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因cDNA序列的克隆及原核表达研究

[目的]克隆八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列并进行原核表达。[方法]以八字地老虎预蛹期幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术克隆基因cDNA序列,将cDNA序列编码区连接到原核表达载体pET21b并转化BL21进行原核表达,并使用His-tag纯化试剂盒将目的蛋白进行纯化。[结果]得到cDNA全长序列,含有2 488个碱基,包括一个1 785个碱基的开放阅读框,编码一个含594个氨基酸的蛋白,分子量为67.8 ku,等电点5.38,该序列登录GenBank并获得登录号FJ848784。诱导表达蛋白经SDS-PAGE电泳得到目的蛋白带,纯化结果也获得了目的蛋白带。[结论]获得了一条新的八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列并对其在原核表达系统中进行了成功表达和纯化。

醋酸酐对太平洋白对虾(Penaeus vannamei)β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制动力学(英文)

β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶与太平洋白对虾的食物消化吸收、蜕壳生长有着密切关系.海水里存在的有机污染物将影响酶生理功能,从而进一步影响虾的正常蜕壳,严重将导致对虾的死亡.醋酸酐是常用的有机溶剂,故本文应用动力学方法研究醋酸酐对太平洋白对虾β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶催化pNP-NAG水解时酶活力的变化规律.表明在醋酸酐浓度低于20.0mmol/L,酶的抑制作用是可逆的,测得醋酸酐对酶抑制的IC50为9.0mmol/L.用双倒数作图法测定醋酸酐与游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)的结合平衡常数.结果显示,醋酸酐是酶的非竞争性抑制剂.用底物反应动力学方法观测在不同底物浓度下酶在0.0、3.0、6.0、9.0、12.0mmol/L的醋酸酐溶液中的失活过程,分别测定了酶的微观失活速度常数k+0及复活速度常数k-0,结果表明醋酸酐对酶的影响是快速结合再缓慢失活的过程.比较微观失活速度常数k+0及复活速度常数k-0,结果显示,在高浓度的醋酸酐溶液中,酶将完全失活.

转录因子Ets-1与β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因启动子结合活性分析(英文)

β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-2,-8(β3GnT-2,β3GnT-8)共同参与多聚N-乙酰氨基乳糖([Galβ1→4GlcNAcβ1→3]n)的合成,从而使得细胞表面的相应糖链结构延长进而影响细胞的恶性转化.已有研究表明,在全反式维甲酸诱导人白血病细胞株HL-60分化过程中β3GnT-2,-8的表达上调,但其分子机制不明.本文旨在探讨ATRA诱导HL-60分化过程中,转录因子Ets-1对β3GnT-2,-8表达调控的分子机制.采用10-6mol/L ATRA诱导人白血病细胞株HL-60向粒系分化,RT-PCR检测到细胞中Ets-1的表达明显增加;进一步采用染色质免疫沉淀(ChIP)结合电泳迁移率变动实验(EMSA)检测证实,有活化的Ets-1结合至β3GnT-2/-8基因调控区.以上结果表明,转录因子Ets-1对人白血病细胞株HL-60分化过程中β3GnT-2,-8基因有表达调控作用.

血清胱抑素C联合尿N-乙酰-?-D-氨基-葡萄糖胺酶检测对过敏性紫癜早期肾损害的诊断意义

目的探讨检测血清胱抑素C(CysC)和尿N-乙酰-?-D-氨基-葡萄糖胺酶(NAG)在过敏性紫癜(HSP)患儿早期肾损害诊断中的临床意义。方法液相透射比浊法检测52例HSP患儿(观察组)的血清CysC,比色法法检测其尿NAG,同时检测尿常规和血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr),并与30例门诊健康体检的儿童(对照组)进行比较。结果观察组患儿入院时血BUN(4.25±0.65)mmol/L,血Scr(50.29±12.43)μmol/L,均处于正常范围。观察组患儿入院时血清CysC和尿NAG水平明显高于对照组(P<0.01);观察组患儿血清CysC单项检测异常率61.5%(32/52),尿NAG单项检测异常率57.6%(30/52),联合检测异常率为80.7%(42/52),联合检测异常率明显高于单项检测(P<0.05)。结论血清CysC、尿NAG联合检测比BUN、Scr、尿常规等传统指标更加灵敏地反映出HSP患儿肾功能早期损伤及程度。

昆虫β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶研究进展

β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是昆虫几丁质代谢中的一种关键酶,在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。因其能够水解几丁质,从而破坏昆虫体壁和围食膜。可以将此酶导入昆虫的体内来破坏其正常的组织结构,也可以通过调控此酶的活性来影响昆虫的生长发育,并为进一步构建杀虫工程菌以及转基因植物提供基因来源。

磷脂酰-N-乙酰氨基葡萄糖苷的合成及脂质体制备

为了提升磷脂酰-N-乙酰氨基葡萄糖苷(PtdGlcNAc)的合成效率,选取不同的咪唑类离子液体,通过以磷脂酶D(phospholipase D,PLD)催化磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)与N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-beta-D-glucosamine,GlcNAc)的转酯反应,探究离子液体预处理对酶催化性能的影响。结果表明,经过1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF_(6)])预处理后,PLD的活性明显高于其他离子液体组和空白组。因此,采用[BMIm][PF_(6)]作为PLD预处理的孵育溶液,通过优化实验,得到最佳反应条件为:1 U的加酶量,底物PC与GlcNAc的物质的量比为1:60,环戊基甲醚作为有机相,离子液体与水体积比为4:1,反应时间12 h,产率为79.7%,与未处理组的产率相比提升了56.9%。将合成的PtdGlcNAc制备成纳米脂质体,并对其结构进行了初步表征。该研究丰富了PLD反应体系的相关研究,为其他新型磷脂酰化合物的合成和应用提供了参考。

以2-甲氧基-4-(2′-硝基乙烯基)酚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为底物测定尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性

目的评价以2-甲氧基-4-(2′-硝基乙烯基)酚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MNP-NAG)为底物的全液体试剂两点终点法测定尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性。方法尿样中NAG作用于底物MNP-NAG水解产生游离MNP,其生成速率与酶活性在一定范围内成正比。结果该法显色最大吸收波长为505nm,试剂1和试剂2最适pH值分别为4.6和10.2,最适底物浓度为16mmol/L,线性范围达198U/L,批内变异系数(CV)和批间CV分别为2.2%和3.8%。166例健康体检者尿样NAG活性参考范围为:(6.21±4.53)U/gCr(x-±1.96s)。结论MNP-NAG底物法测定尿NAG灵敏度高,操作简便,结果可靠,适合临床应用。

尿液胱抑素C与β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶联合检测对肾小管损伤的诊断价值

目的探讨尿液中胱抑素C(CysC)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)联合检测在肾小管损伤中的价值。方法收集130例肾小管损伤患者(病例组)和100例健康人(健康对照组)的尿液标本,分别检测其CysC浓度和NAG活性。结果联合检测CysC和NAG对肾小管损伤的辅助诊断敏感度为85.4%,特异度为89.6%,阳性预测值为82.1%。干预治疗前后比较,病例组患者尿液CysC浓度和NAG活性水平差异均有统计学意义(P<0.05)。结论尿液CysC和NAG联合检测对肾小管损伤的诊断和疗效监测价值显著。

解淀粉芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及其酶学表征

从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens YX-01)中克隆得到一个新型β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(BaNagase),并成功在大肠杆菌中异源表达。BaNagase编码616个氨基酸,与B.subtilis来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(AIY91451.1)氨基酸序列相似性最高,为76.97%。通过对比分析,BaNagase属于糖苷水解酶3家族。纯化获得的BaNagase比活力为16.42 U/mg,最适温度65℃,最适pH 6.0,且在低于55℃条件下能保持高于70%的酶活力。BaNagase展现出高的热稳定性和严格的底物特异性,为其高效制备N-乙酰氨基葡萄糖提供了理论支持。

蛋白质的氧连-N-乙酰葡萄糖胺修饰在心血管疾病中的保护作用

蛋白质的氧连-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,参与调控细胞的多种生物学功能,如增殖、分化、迁移、黏附及凋亡。近来研究表明,快速调节细胞内蛋白质O-GlcNAc修饰水平可通过抑制炎症反应、减少细胞凋亡以及诱导热休克蛋白的表达等途径,参与调节心血管损伤早期的局部炎症以及抑制损伤后期的心肌及血管重构,从而发挥心血管保护作用。此文主要就O-GlcNAc修饰的动态调节过程及其机制、生物学功能及其与动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的关联方面作一综述。