水稻OsTLP12基因启动子GUS表达载体的构建与转化

植物中类甜蛋白TLPs不仅参与宿主抵御真菌入侵的过程,还参与植物对非生物胁迫的防御。本试验采用PCR技术从籼稻特青中克隆了OsTLP12基因上游2000 bp的启动子片段,并分析了其中所含的顺式作用元件。随后,构建了与GUS报告基因融合的表达载体,并通过农杆菌介导的转化方法将融合表达载体导入水稻中,随后进行了转化植株的筛选,并对转基因植株进行了GUS染色分析。本研究得到以下结果:1) 成功克隆了水稻中OsTLP12基因的启动子片段,并将其与含有GUS报告基因的表达载体融合,获得了融合表达载体;2) OsTLP12基因启动子区域含有多个生物和非生物逆境反应相关的顺式元件;3) 成功将融合表达载体转化进入水稻中,并筛选出阳性转基因幼苗;4) 对转基因幼苗进行了GUS染色,以检测OsTLP12基因启动子驱动的GUS表达情况。

苜蓿愈伤组织诱导及GUS基因瞬时表达

用电击转化法将质粒pBI12 1(含GUS基因 ,β 葡萄糖苷酸酶基因 )导入苜蓿愈伤组织的小细胞团内 。

用基因枪将GUS基因导入褐藻细胞中表达

于1993年11月-1994年2月，用高压氦气式基因枪，将PB1221质粒[装有CaMV35s启动子、GUS（β-葡精苷酸酶）基因以及nos的3’调控区]导入海带和裙带菜组织切块中。48h后，在海带假根细胞和裙带菜中肋部叶片细胞中检测到GUS基因的表达。实验表明，微粒子轰击法是外源基因导入大型褐藻的一个有效途径。CaMV35s启动子能够驱动外源基因在海洋藻类中的表达，可作为藻类基因工程的启动元件。

GUS基因在杜氏盐藻细胞中的瞬间表达

利用电激法将GUS基因转入杜氏盐藻细胞内进行瞬间表达 ,研究了盐藻的生长状态和电激转化条件对转化率的影响 ,并比较了CaMV35S、Ubil、Ubil Ω、CaMV35S U bil和CaMV35S Ubil Ω 5种启动子的转化效率。结果表明 ,培养 5d的盐藻在 6kV的脉冲电压、0 .0 5s的脉冲持续时间和 2 10的脉冲次数下电激可获得较高的转化率 ,为转化最佳条件。 5种启动子中 ,Ubil Ω启动子的转化效率最高 。

建立低能离子束介导小麦转基因方法并获得转GUS基因植株

研究了注入离子种类、能量、剂量等参数对于低能离子束介导的遗传转化的影响，建立了适于小麦成熟胚转化的组培条件和筛选程序。以携带ＧＵＳ基因的质粒为供体，进行了报告基因转化研究。分子生物学证据表明ＧＵＳ基因已整合到小麦基因组中。３个小麦品种的抗性愈伤转化率分别为 ９．５％、 １０．８％、 １１．２％，再生植株转化率分别为 １．４％、 ３．４％、 １７％。首次证明了离子束介导小麦遗传转化是可行的，为离子束介导小麦遗传转化体系的建立打下了基础。

转基因白桦中GUS基因表达的定量分析

以转基因白桦(Betula platy phylla)为材料,采用单酶切结合Southern杂交的方法揭示不同转基因植株中GUS基因的整合拷贝数为1-4个。采用组织化学染色法定性分析不同整合方式转基因白桦植株中GUS基因的表达。结果表明,11个转基因植株中有2株出现了GUS基因沉默,其余植株均有不同水平的GUS表达。在此基础上应用分光光度法定量分析不同拷贝数的GUS转基因白桦中β-葡萄糖醛酸酶活性。结果表明,在11个转基因无性系中除2个株系的GUS基因沉默外,其它9个转基因植株中GUS酶活力差异明显,但这种差异与GUS基因的拷贝数没有必然联系。

高羊茅组织培养再生体系及GUS基因瞬间表达研究

以成熟种子为外植体,对高羊茅组织培养和植株再生体系进行了优化,分析了不同浓度2,4-D、6-BA和激动素对高羊茅愈伤组织诱导和愈伤组织分化成苗的影响,结果表明:9.0mg/L2,4-D对愈伤组织的诱导效果最佳,0.2mg/L激动素是愈伤组织分化成苗的最适浓度,二者的诱导率和分化率分别达到68.08%和45.83%.在愈伤组织继代培养基中附加1.0mg/L2,4-D、0.5mg/L6-BA和1.25mg/LCuSO4有利于胚性愈伤组织的形成,可以明显促进愈伤组织分化.同时,采用基因枪法将GUS基因导入高羊茅愈伤组织中,通过组织化学染色检测到了GUS瞬间表达活性;并对影响GUS基因瞬间表达的因素进行了分析,以期为提高基因枪法遗传转化效率提供参考.

抗氧化剂对农杆菌介导的大豆下胚轴GUS基因瞬时表达的影响

大豆(Glycine max)下胚轴作为大豆遗传转化的外植体材料,能快速高频再生不定芽。然而,在遗传转化过程中褐化影响基因转化效率。在该研究中,我们用含有GUS染色基因和hptII(Hygromycin phosphotransferase II)筛选基因的农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404侵染大豆下胚轴,并用组织化学定位法测定了GUS基因的瞬时表达,以确定大豆的优化基因转化条件。结果显示,在共培养基中加入硫代硫酸钠、L_半胱氨酸以及二硫苏糖醇等抗氧化剂,可以有效地抑制大豆下胚轴在组培过程中褐化的发生,并大幅度提高农杆菌在下胚轴的瞬时表达率。这些结果说明抗氧化剂可以降低这种影响并有效提高基因转化效率。

兰花圆球茎基因枪转化后的GUS基因表达

利用花椰菜花叶病毒 (CaMV ) 35S启动子引导的葡糖醛酸糖苷酶 (β glu curonidase ,GUS)基因检测基因枪法转化兰花圆球茎组织的瞬间表达效率。发现在基因枪轰击时在DNA 金粉悬液中加入 0 1mol/L的生长激素NAA ,轰击前预培养时使用0 1mol/L甘露醇处理 ,每个培养皿轰击两次和轰击压力为 110 0 psi下 。

GUS基因和NPTII基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用

利用农杆菌介导转化法,将含有35S启动子驱动NPTII基因和GUS基因以及棉纤维特异表达启动子E6驱动目的基因FB的植物表达载体转入到常规棉花R15中。重点分析了GUS基因和NPTII基因在愈伤诱导阶段、T0代及T1代转基因棉花中的表达情况。综合两个基因的表达来进行转基因棉花的阳性鉴定,可以为转基因棉花后代的纯合选育提供双重保障。7个转基因株系选育到T3代共获得株行51个,卡那霉素检测多数株行阳性率在90%以上,其中21个株行阳性率达100%。

利用GUS基因瞬时表达探索佛手叶盘基因枪转化参数

佛手是芳香科枸橼类植物,有很好的药用和观赏价值,但其品种较为单一,对其进行遗传改良和品种选育显得十分必要.为了将基因枪转化方法应用于佛手的遗传改良和品种选育,本实验以GUS基因为报告基因,利用基因枪方法将其转入金华佛手外植体内,通过检测GUS基因在佛手叶盘中的瞬时表达情况,分析了外植体的幼嫩程度、射程、氦气压力、真空度、轰击次数等参数对GUS瞬时表达的影响,并研究了最佳检测时间.结果表明,以幼叶为受体,在射程为6 cm、氦气压力为7.584×106Pa,真空度为88.046 kPa条件下,2 d后可检测出GUS基因的最佳表达活性.轰击次数多少对GUS基因瞬时表达影响不明显.

基于GUS基因瞬时表达优化云南杜鹃(Rhododendron yunnanense Franch.)遗传转化方法

本研究以云南杜鹃无菌叶片和愈伤组织为受体材料,运用正交试验设计,通过组织染色分析法研究了预培养时间、菌液密度、侵染时间、共培养时间对农杆菌介导的GUS基因瞬时表达的影响。结果表明:叶片是云南杜鹃较理想的遗传转化受体材料,无菌叶片预培养0 d,菌液OD_(600)值0.5,侵染时间40 min,共培养5 d,GUS基因瞬时表达率最高,平均表达率为70%。试验结果为云南杜鹃遗传转化研究提供了快速可靠的依据。

转基因水稻中GUS蛋白质的检测及其表达特征

【目的】建立转基因水稻中GUS蛋白质的免疫学检测方法,并了解花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以细菌基因组DNA为模板,PCR扩增GUS基因后克隆到表达载体pET30a中,测序验证的重组子转入大肠杆菌表达菌BL21中,IPTG诱导获得重组表达的GUS蛋白质,用HIS-tag beads纯化后作为免疫原免疫小鼠制备GUS蛋白质特异的抗体,通过免疫印迹分析筛选高特异性的单克隆抗体,用Broadford法对重组的GUS蛋白质进行定量,对不同浓度的GUS蛋白质进行免疫印迹分析,绘制检测GUS蛋白质的标准曲线,通过与标准曲线的比较对水稻叶片中GUS蛋白质进行定量分析。提取不同时期、不同部位的水稻总蛋白质,包括苗期的地上部、地下部,分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶枕、叶片上部、叶片中部和叶片下部,孕穗期的茎、穗轴、叶鞘、叶枕、叶片、幼穗(长度分别为1、2、10和20 cm),开花期的茎、穗轴、叶鞘、叶片、穗子,成熟期的茎、叶片、授粉后不同时期的种子(分别为授粉后10、20、30和40 d)、乳熟期的胚、胚乳和颖壳、成熟种子的全种子、胚、胚乳和颖壳以及不同时期的叶片和根部材料等。SDS-PAGE分离后用抗体检测其GUS蛋白质的丰度。【结果】筛选获得了高特异性的抗GUS单克隆抗体(编号为#27),用该抗体检测转基因水稻中及重组的GUS蛋白质均呈现特异条带,没有可见的背景信号,用本研究建立的免疫印迹方法对重组GUS蛋白质的检测下限约为4 ng,可检出转基因水稻单粒大米2.5%样品中(约0.6 mg)的GUS蛋白质。在不同时期的转基因水稻叶片中GUS蛋白质的表达丰度基本稳定,而在水稻根部的GUS丰度随生长急剧减少,5叶期根中的表达量不到3叶期的三分之一,到6叶期检测不到GUS蛋白质。在水稻苗期叶片中,GUS蛋白质约占鲜重的0.02‰。另外,除分蘖期以后的根部之外,GUS蛋白质几乎在所有的水稻组织部位中呈组成型表达,只是不同组织中的表达量略有差异,如在孕穗期和开花期的茎及颖壳中的表达量较低。【结论】建立了具有应用价值的对转基因水稻中GUS蛋白质丰度检测的免疫印记方法。该方法特异性高、样品用量少、不依赖于GUS蛋白质的酶活性、测定结果易于在不同实验室间比较。证明了35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中基本呈组成型表达。

农杆菌介导的半夏GUS基因瞬时表达

采用根癌农杆菌感染半夏无菌叶片、叶柄和愈伤组织,对GUS基因的瞬间表达进行研究,并分析了不同转化受体、感染时间、菌液浓度、共培养、预培养时间、菌种对GUS基因的瞬间表达的影响。结果显示,以半夏的无菌苗叶柄和愈伤组织,在OD值为0.2的EHA101或EHA105农杆菌液中感染15 min,叶柄暗处共培养3 d,愈伤组织2 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达。

不同调控序列控制下的gus基因在柑桔原生质体中的瞬间表达

通过ＰＥＧ法及转化脂介导法将不同调控序列控制下的ｇｕｓ基因导入柑桔原生质体中，研究了ｇｕｓ基因在柑桔原生质体中的瞬间表达情况，结果表明，在柑桔原生质体中，控制ｇｕｓ基因表达水平的能力由大至小依次为ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、ＡｄｈＩ启动子及ｒｂｃｓ启动子，内含子的存在可以提高ｇｕｓ基因在柑桔原生质体中的表达水平。

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达。采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达。为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础。

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

【目的】以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体。【方法】采用PCR方法和基因枪法。【结果】用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段。然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达。采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色。【结论】构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础。

基因枪作用下的外源GUS基因在四种红藻组织块中的瞬间表达

建立合适的外源基因转移系统是大型海藻基因工程的一个重要研究内容。外源基因在大型海藻组织中的瞬间表达可以确定外源基因是否导入海藻组织及研究影响导入的各种因素，以此来建立合适的ＤＮＡ导入系统。迄今，秦松等［１９９４］对海带的遗传转化进行了研究，用基因枪将...

Ac/Ds(GUS)结构介导的水稻启动子捕获系统的建立

构建了基于Activator/Dissociation(β-glucuronidase)[简称Ac/Ds(GUS)]结构的捕获质粒p13B,用于分离水稻基因启动子。以此质粒用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,对获得的18个独立转化株的T2代植株进行了抗除草剂筛选,从141个抗除草剂转基因植株中用PCR方法检测到其中37株是Ds因子发生了转座的植株,而且这种转座到新位置上的Ds因子是遗传的。初步观察到其中5株的GUS染色呈阳性。

Gus基因在转基因棉花细胞中的表达及其与NPTⅡ基因、Bt基因表达的相关性

通过农杆菌介导法将含有 Gus基因、NPT 基因、Bt基因的 Ti质粒转入棉花细胞中 ,用Gus组织化学检测法检测转化愈伤组织、再生棉株 R0 、R1和 R2 代植株组织细胞中的 Gus基因表达的水平 ,并用 NPT 活性速测法和室内生物测虫法检测三个外源基因在 R0 、R1和 R2 代植物植株组织中的表达情况 ,分析三者存在及表达的相互关系。结果表明 ,Gus基因在转化愈伤组织细胞有丝分裂增殖过程中能稳定遗传给后代细胞。转化棉株 R0 、R1和 R2 代 Gus活性、NPT 活性、抗虫性三者有一定的相关性但不完全是共表达的 。