NF-κB在抗β_2GPⅠ/β_2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:使用一定剂量的抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物处理THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性;Western blot检测细胞NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达情况;进一步采用NF-κB抑制剂(PDTC)观察是否能干预抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应,并利用上游信号分子MAPKs的抑制剂观察抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对NF-κB p65磷酸化的影响。结果:抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)能够诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);能够增强细胞内NF-κB p65磷酸化(P<0.05 vs media),降低IκB-α水平(P<0.05 vs media);NF-κB抑制剂PDTC(20μmol/L)能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞表达TF及NF-κB磷酸化的效应;MAPKs抑制剂均能影响抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞NF-κB p65磷酸化。结论:在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,NF-κB被激活并发挥重要作用,MAPKs为NF-κB的关键上游分子。

Toll样受体4在抗β_2GPⅠ-β_2GPⅠ复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症因子中的作用

目的观察抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的效果,探讨Toll样受体4(TLR4)在其中的作用。方法对C3H/He N(TLR4正常)小鼠、C3H/He J(TLR4缺陷)小鼠腹腔注射非特异性兔Ig G(R-Ig G)、抗β2GPⅠ抗体,72 h后用细胞免疫荧光法检测小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物对小鼠腹腔巨噬细胞进行体外刺激,荧光定量PCR法检测细胞表达上述因子的mRNA水平,western blot法检测其蛋白质分泌水平。结果抗β2GPⅠ抗体刺激的C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显高于C3H/He J小鼠,并经细胞免疫荧光法验证;经体外刺激后,荧光定量PCR法结果显示抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物诱导C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平高于空白组或C3H/He J刺激组(P均<0.01);western blot结果显示C3H/He N来源细胞TNF-α、IL-1β、IL-6分泌均显著高于C3H/He J来源细胞(P均<0.01)。结论抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物能够促进小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,TLR4为介导此过程的受体之一。

oxLDL-β_2 GPⅠ复合物与冠心病病情的相关性

目的探讨冠心病(CAD)患者血清中氧化型低密度脂蛋白-β2糖蛋白Ⅰ复合物(oxLDL-β2GPⅠ)水平以及与病情的相关性。方法应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测210例CAD患者及180例对照者血清中oxLDL-β2GPⅠ水平,并作与病情的相关性分析。结果轻、中、重及超重度CAD患者血清中ox-LDL-β2GPⅠ水平分别为(1.91±0.76)U/mL、(2.27±0.93)U/mL、(4.65±1.28)U/mL和(8.04±3.12)U/mL,均明显高于对照组,并且CAD患者的血清oxLDL-β2GPⅠ水平与其冠状动脉狭窄程度呈正相关(r=0.387,P<0.05)。结论 CAD患者血清oxLDL-β2GPⅠ水平的增高能反映CAD的严重程度,可用于CAD的病情评估。

oxLDL/β_2GPⅠ复合物与自身免疫背景下AS的关系

在动脉粥样硬化发展过程中,动脉内膜上形成的oxLDL/β2GPⅠ复合物可以释放到循环血液中。在SLE、APS等自身免疫疾病中,可以检测到抗oxLDL/β2GPⅠ复合物的自身抗体,与动脉血栓的形成有高度相关性。本文就自身免疫疾病背景下,对oxLDL/β2GPⅠ复合物的存在、生物学功能及其与动脉粥样硬化关系的研究进展进行综述。

抗β_2GPⅠ抗体/β_2GPⅠ与PLT活化

近年来，血栓性疾病发病率不断上升，严重威胁人类健康和生命，血小板（PLT）活化是血栓形成的始动因素，在血栓形成中起到关键作用。研究发现抗β2糖蛋白Ⅰ（β2GPI）抗体出现在多种血栓性疾病中，常见于抗磷脂综合征，能使体内PLT活化并和纤维蛋白结合，引起PLT聚集，

hβ_2GPⅠ第一功能区基因单体和二串联体的克隆和表达

目的:构建h2βGPⅠ(h2βGPI)第一功能区基因单体及二串联体的原核表达载体PQE30-β2GP-ⅠDI和PQE30-β2GPⅠ-DI2,并在大肠杆菌M15中进行高效表达。方法:应用PCR技术扩增hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体β2GPⅠ-DI,并根据同尾酶特性构建hβ2GPⅠ第一功能区基因二串联体β2GPⅠ-DI2,将获得的单体和二串联体分别与PGEM-T easy载体连接测序,测序正确后分别克隆于原核表达载体PQE30中,构建成重组表达载体PQE30-β2GPⅠ-DI和PQE30-β2GPⅠ-DI2,在大肠杆菌M15中以l mmol.L-1IPTG诱导蛋白表达,经Western blotting鉴定目的蛋白的抗原性。结果:表达了hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体及二串联体的蛋白,相对分子质量约为9 000和17 000,其表达量均可达菌体总蛋白的25%,并具有hβ2GPⅠ的抗原性。结论:成功构建了hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体及二串联体的原核表达载体,并诱导了蛋白的高效表达。

Toll样受体4在抗β_2GPⅠ抗体诱导小鼠血管表达黏附分子及组织因子中的作用

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在抗β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)抗体诱导小鼠动脉血管黏附分子及组织因子(TF)表达中的作用。方法腹腔注射抗β2GPⅠ抗体,分别刺激C3H/He N(TLR4正常)与C3H/He J(TLR4点突变)小鼠72 h,用免疫组织化学法观察血管内膜组织中细胞黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及E-选择素的蛋白质表达水平,用实时荧光定量PCR和western blot方法分别检测血管组织匀浆中ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的mRNA和蛋白质表达水平,用实时荧光定量PCR和TF活性检测试剂盒分别检测血管组织匀浆中TF mRNA表达水平及其活性。结果免疫组化结果示抗β2GPⅠ抗体刺激后的C3H/He N小鼠血管内膜中ICAM-1、VCAM-1及E-selectin蛋白均表达增强。与生理盐水对照组相比,C3H/He N小鼠和C3H/He J小鼠经抗β2GPⅠ抗体刺激后,其血管组织匀浆中ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的mRNA和蛋白质表达水平均显著增加(P均<0.05);但C3H/He J小鼠的ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的mRNA和蛋白质表达水平均明显低于C3H/He N小鼠(P均<0.05)。经抗β2GPⅠ抗体刺激的C3H/He J小鼠血管匀浆中TF mRNA表达及生物学活性明显低于C3H/He N小鼠(P<0.05)。结论 TLR4与抗β2GPⅠ抗体刺激上调小鼠动脉血管组织表达活性分子ICAM-1、VCAM-1、E-选择素及TF密切相关,其分子机制及其在抗磷脂综合征(APS)血栓形成中的病理机制有待深入研究。

抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体、膜糖蛋白GPⅠb及抗链球菌溶血素O检测在类风湿关节炎急性阶段的诊断价值

目的探讨抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体、膜糖蛋白GPⅠb、抗链球菌溶血素O检测在类风湿关节炎急性阶段的诊断价值。方法收集67例类风湿关节炎急性阶段患者为病例组,选取院内体检健康者50例为对照组。采用酶联免疫吸附试验检测抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体,流式细胞术检测血小板膜糖蛋白GPⅠb的表达,免疫比浊法检测抗链球菌溶血素O的水平。采用Pearson分析进行相关分析,利用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体、血小板膜糖蛋白GPⅠb、抗链球菌溶血素O诊断类风湿关节炎急性阶段的曲线下面积(AUC)。结果病例组抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体、膜糖蛋白GPⅠb、抗链球菌溶血素O水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。Pearson相关性分析中,抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体、膜糖蛋白GPⅠb、抗链球菌溶血素O与类风湿关节炎急性阶段呈正相关(r=0.514、0.620、0.710)。ROC曲线分析显示,抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体、膜糖蛋白GPⅠb、抗链球菌溶血素O的AUC分别为0.82、0.82、0.91,最佳诊断界值分别为21.84RU/mL、14.79%、51.32IU/mL。结论抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体、膜糖蛋白GPⅠb、抗链球菌溶血素O检测对类风湿关节炎急性阶段具有一定的诊断价值,可作为类风湿关节炎急性阶段的辅助诊断指标。

β_2糖蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)单克隆抗体(MAbs),并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的人血浆β2GPⅠ免疫BALB/c小鼠,采用PEG融合技术,间接ELISA法和有限稀释法,制备和筛选杂交瘤细胞。杂交瘤细胞继续扩大培养后注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,经硫酸铵沉淀及Protein G纯化MAbs。秋水仙素阻抑法鉴定杂交瘤细胞株染色体数目,ELISA测定滴度,Ig亚类试剂盒鉴定Ig亚类,Western blot鉴定特异性。结果:获得1株稳定分泌MAbs的杂交瘤细胞株β2,该杂交瘤细胞株的染色体数为99～108。进一步研究发现,其培养液和腹水滴度为1∶29和1∶215,其MAbs分类为IgG1/κ,Western blot显示纯化的MAbs及标准anti-β2GPⅠ与β2GPⅠ均有反应条带,具有较好的特异性。结论:成功获得并纯化β2GPⅠ单克隆抗体,为进一步研究β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ复合物在抗磷脂综合征中的作用奠定了基础。

抗β_2-糖蛋白Ⅰ抗体与反复自然流产的关系

目的:探讨抗β2-糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β2-GPⅠantibody)与反复自然流产(RSA)的关系。方法:采用酶联免疫吸附法检测81例RSA患者和39例正常妇女血清中anti-β2-GPⅠ的水平。结果:RSA组anti-β2-GPⅠ及其IgG型抗体阳性率分别为42.0%和40.8%,显著高于对照组(7.7%)(P<0.01,P<0.05);IgM型抗体阳性率与对照组比较差异无显著性(P>0.05);早期与中晚期RSA两组间及RSA 2次与RSA≥3次两组间阳性率比较差异均无显著性(P>0.05)。结论:anti-β2-GPⅠ与RSA有关,可作为RSA免疫因素的辅助诊断指标。

糖尿病视网膜病变患者血清β_2-糖蛋白Ⅰ的表达

目的探讨血清β2-糖蛋白Ⅰ(beta2-glycoproteinⅠ,β2-GPⅠ)在不同时期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)患者中的变化,了解血清β2-GPⅠ与DR的关系。方法收集60例2型糖尿病患者血清标本,将其分为3组:20例无明显DR(no-DR,NDR)患者为NDR组;20例非增生性DR(non-proliferative DR,NPDR)患者为NPDR组;20例增生性DR(proliferative DR,PDR)患者为PDR组。同时收集20例健康人血清为正常对照(normal control,NC)组。应用Westernblot方法,对各组随机抽取的4份血清样本中β2-GPⅠ水平进行分析。结果β2-GPⅠ水平在NPDR组、PDR组大量表达,在NDR组中量表达,在NC组少量表达。NC组、NDR组、NPDR组和PDR组各条带面积平均光密度值,分别为(440564.9±66597.4)mm-2、(655561.6±85640.8)mm-2、(859969.7±85461.0)mm-2、(954887.4±125764.4)mm-2。与NC组比较,β2-GPⅠ水平在NDR组、NPDR组、PDR组显著升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);与NDR组比较,β2-GPⅠ水平在NPDR组、PDR组显著升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);与NPDR组比较,PDR组无明显升高,差异无统计学意义(P>0.05)。结论在DR发生过程中,血清β2-GPⅠ水平上调,β2-GPⅠ可能具有潜在的早期诊断DR的价值。

SMMC-7721肝癌细胞膜上β_2糖蛋白Ⅰ受体的表达

目的:研究β2糖蛋白I(β22GPI)与 SMMC-7721肝细胞膜的相互作用过程,探讨乙型肝炎病毒(HBV)嗜肝性的发生机制．方法:采用荧光显微镜及流式细胞仪分析的方法．检测SMMC-7721、HL-60及SGC-7901 三种细胞膜与FITC-β2GP I相结合的情况以及二者的结合特性．结果:仅SMMC-7721细胞膜表面附有大量荧光,其余2种细胞无此现象．加FITC-β2GP I 20 μL时,SMMC-772 1与FITC-β2GP I 的结合率为19％,明显高于FITC-β2GP I与 HL-60的结合率(1．7％)及与SGC-7901的结合率(1．9％)(P<0．01)．加FITC-β2GP I 50μL 时,SMMC-7721与FITC-β2GP I的结合率为 20．8％,与20 μL的结合率无差异(P>0．05),说明SMMC-7721与FITC-β2GP I的结合率不随 FITC-β2GP I量的增加而增高．结论:在SMMC-7721肝细胞膜表面存在能与人β2GP I特异结合的蛋白．

兔抗人β_2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备兔抗人β2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及功能活性。方法以纯化的人血浆β2糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)免疫新西兰大白兔,获得抗血清;利用Protein A及β2-GPI亲和层析柱纯化血清中总IgG和抗β2-GPI多克隆抗体;用免疫双向扩散试验(IDD)、ELISA和western-blot等方法鉴定抗体。结果IDD及ELISA鉴定抗体效价分别达到16和1×105;western-blot显示纯化的总IgG和抗β2-GPI抗体与β2-GPI蛋白均有特异反应条带;且抗体与β2-GPI复合物能够刺激单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)活性。结论成功获得并纯化兔抗人β2-GPI多克隆抗体,为进一步研究β2-GPI/抗β2-GPI复合物在抗磷脂抗体综合征血栓形成机制中的作用建立了基础。

抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体诱导血液单核细胞表达组织因子活性的机制探讨

目的:探讨抗β2糖蛋白Ⅰ(抗β2GPⅠ)抗体诱导血液单核细胞表达组织因子(TF)活性的机制。方法:利用纯化的抗磷脂综合征(APS)患者血清IgG、单克隆抗β2GPⅠ抗体、抗Annexin A2抗体等刺激血液单核细胞及单核细胞株,通过凝血因子Ⅹa的生成量,判断细胞TF活性的表达;利用W estern杂交技术检测单核细胞膜表面AnnexinA2的表达;采用免疫细胞化学染色判断单核细胞膜表面Annexin A2、β2GPⅠ、抗β2GPⅠ抗体的结合情况。结果:APS患者血清IgG和抗β2GPⅠ抗体显著增强单核细胞TF的表达;单核细胞膜表达的Annexin A2与β2GPⅠ/抗β2GPⅠ结合成复合物,引发细胞TF表达增强;抗Annexin A2抗体可抑制复合物的这种作用。结论:细胞表面Annexin A2介导β2GPⅠ/抗β2GPⅠ诱导单核细胞表达TF活性,是APS血栓形成的机理之一。

系统性红斑狼疮患者血浆内皮微粒和抗β_2-糖蛋白Ⅰ抗体的检测

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种自身免疫性疾病,可引起全身多脏器损害,临床上常出现静脉血栓、血小板减少、溶血性贫血及神经系统改变等表现,研究表明SLE的许多临床表现与血栓形成密切相关,而内皮功能障碍在血栓形成中亦扮演着重要角色,内皮微粒（endothelial mi-croparticles，EMP）是内皮细胞凋亡或激活时释放的亚微米级颗粒，检测血浆中EMPs的水平是新近提出的评估内皮功能障碍的方法。

oxLDL/β2GPⅠ/aβ2GPⅠ复合物通过TLR4/MyD88/NF-κB途径促进血管内皮细胞血管生成

目的探讨氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)/β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体(aβ2GPⅠ)复合物对血管内皮细胞增殖、迁移及血管生成的影响及其机制。方法将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养至对数生长期,分为对照组(正常培养)、oxLDL组(50 mg/L oxLDL)、oxLDL/β2GPⅠ/aβ2GPⅠ组(50 mg/L oxLDL/100 mg/Lβ2GPⅠ/100 mg/L aβ2GPⅠ)和血管内皮生长因子(VEGF)组(100μg/L VEGF)。实时荧光定量PCR(qPCR)法检测血管生成相关因子VEGF、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、基质金属蛋白酶(MMP)-2及MMP-9的基因表达;CCK-8检测细胞增殖;划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;基质胶管腔形成实验检测HUVEC的血管生成能力;Western blot法检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)和核因子κB(NF-κB)的蛋白表达。结果与对照组相比,oxLDL/β2GPⅠ/aβ2GPⅠ组细胞增殖活力在处理48 h时增加;此外,与对照组相比,oxLDL/β2GPⅠ/aβ2GPⅠ组细胞迁移及血管生成能力增强,VEGF、VE-cadherin、MMP-2及MMP-9的mRNA水平升高(P<0.05),TLR4和MyD88蛋白水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高(P<0.05)。结论oxLDL/β2GPⅠ/aβ2GPⅠ复合物可能通过TLR4/MyD88/NF-κB通路诱导血管内皮细胞增殖、迁移及血管生成。

结缔组织病中抗心磷脂抗体和抗β_2-糖蛋白Ⅰ抗体的表达特点

目的探讨IgA/IgG/IgM类抗心磷脂抗体(a CL)和抗β_2-糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β_2-GPⅠ)在结缔组织病(CTD)中的表达特点。方法酶联免疫吸附法检测9类共546例CTD患者血清IgA/IgG/IgM类a CL和anti-β_2-GPⅠ水平,分析比较这6个指标在9类CTD中的分布差异。结果在9类CTD之间a CL-IgA、a CL-IgG、anti-β_2-GPⅠ-IgA和anti-β_2-GPⅠ-IgG的浓度和阳性率差异均有统计学意义(浓度:P=0.002,0.000,0.004,0.013;阳性率:P=0.031,0.000,0.016,0.002),但a CL-IgM和anti-β_2-GPⅠ-IgM的浓度和阳性率在9类CTD间差异无统计学意义(浓度:P=0.282,0.095;阳性率:P=0.342,0.324)。546例CTD患者a CL-IgA、a CL-IgG、a CL-IgM、anti-β_2-GPⅠ-IgA、anti-β_2-GPⅠ-IgG和anti-β_2-GPⅠ-IgM等6种抗体的阳性率分别为5.3%、8.4%、9.3%、7.1%、6.2%和18.1%。其中a CL-IgA与anti-β_2-GPⅠ-IgA阳性率以及a CL-IgG与anti-β_2-GPⅠ-IgG阳性率差异无统计学意义(P=0.21,0.163),但a CL-IgM和anti-β_2-GPⅠ-IgM阳性率差异有统计学意义(P=0.000)。进一步分析表明a CL的IgA与IgG之间以及IgA与IgM之间阳性率差异有统计学意义(P=0.042,0.011),而anti-β_2-GPⅠ中阳性率的显著差异存在于IgG与IgM之间和IgA与IgM之间(P=0.000,0.000)。结论 9类CTD之间IgA/IgG类、以及9类CTD总体IgM类a CL和anti-β_2-GPⅠ阳性率存在差异;a CL中IgG与IgM表达占优势,而anti-β_2-GPⅠ的优势表达抗体为IgM。

抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体在糖尿病视网膜病变预测中的价值

2型糖尿病（type 2diabetes mellitus,T2DM）多见于中老年人,是一种由于胰岛素代谢紊乱导致血糖异常升高的疾病[1]。

膜联蛋白A_2介导β_2糖蛋白Ⅰ/抗β_2糖蛋白Ⅰ复合物刺激单核细胞上调表达组织因子

目的探讨膜联蛋白A2是否介导β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)/抗β2糖蛋白Ⅰ结合于单核细胞表面,从而诱导单核细胞表达组织因子。方法利用纯化的抗磷脂综合征(APS)患者血清IgG、单克隆抗β2糖蛋白Ⅰ抗体、抗膜联蛋白A2抗体等刺激血液单核细胞及THP-1单核细胞株,通过凝血因子Ⅹa的生成量,判断细胞组织因子活性的表达;把带有膜联蛋白A2cDNA的载体转染入HEK293T细胞,然后用β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ复合物刺激,观察转染前后HEK293T细胞的组织因子表达情况;采用RNA干扰技术封闭单核细胞株THP-1膜表面的膜联蛋白A2,观察组织因子的表达情况。结果 APS患者血清IgG和抗β2糖蛋白Ⅰ抗体显著增强单核细胞组织因子的表达;HEK293T细胞转染膜联蛋白A2cDNA后组织因子的mRNA和蛋白的表达量较转染前增高;采用RNA干扰降低膜联蛋白A2表达后单核细胞株THP-1的组织因子表达显著降低。结论细胞表面膜联蛋白A2介导β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ诱导单核细胞表达组织因子活性,是APS血栓形成的机制之一。