不同诱导剂及培养条件对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)β2毒素基因的表达载体p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测了不同培养条件下,该毒素基因在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌株中的表达情况。结果表明,p ETXB2重组质粒中的β2毒素基因位于p ET-28c(+)表达盒中,且阅读框架和基因序列正确。以IPTG为诱导剂时,重组菌株BL21(DE3)(p ETXB2)的最佳培养条件为37℃,p H7.0,IPTG终浓度0.8 mmol·L-1,诱导4 h;以乳糖为诱导剂时,其最佳培养条件为37℃,p H 7.0,乳糖终浓度0.5 g·L-1,诱导5 h。

IPTG诱导剂对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对已构建的含β2毒素基因重组质粒p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测不同培养条件下β2毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实,p ETXB2重组质粒含有β2毒素基因而且阅读框架和基因序列正确。同时采用IPTG诱导剂在改变培养基的p H、培养温度、诱导剂的加入量及诱导时间4个方面对β2毒素基因表达进行调控,其最佳的表达条件是37℃,p H 7.0的培养基中,用终浓度为0.8 mmol/L IPTG诱导4 h,β2毒素蛋白的表达效果最好。

江西地区仔猪肠道A型产气荚膜梭菌的分离及其β_2毒素的研究

为研究A型产气荚膜梭菌(CpA)的β_2毒素对仔猪坏死性肠炎(NEC)的影响,本试验采用改良FTG培养基从江西地区健康与腹泻哺乳仔猪新鲜粪便中初分离Cp,再对所分离Cp菌株进行生化和16S r DNA分子鉴定,统计江西省7个地区健康和腹泻仔猪肠道Cp分离率;通过多重PCR技术对CpA菌株及CpA β_2^+毒素基因携带率进行测定;将CpA(β_2^+/β_2^-)分离株进行小鼠毒性试验。结果显示:255份哺乳仔猪粪便样品中,腹泻样品Cp分离率为89.6%(138/154),健康样品Cp分离率为90.1%(91/101),其中CpA占分离菌株的89.5%(205/229);CpA菌株的β_2毒素携带率为99.5%(204/205),表明江西地区仔猪肠道CpA携带率及CpA(β_2^+)比例均较高;所分离的CpA菌株通常携带2个以上质粒,且β_2毒素基因位于CpA菌其中的质粒中;来源于腹泻仔猪的CpA(β_2^+)、CpA(β_2^-)和健康仔猪的CpA(β_2^+)培养上清分别以腹腔接种小鼠,均可引起小鼠不同程度死亡。从小鼠毒性试验结果表明CpA与菌株来源健康或腹泻仔猪、是否携带β_2毒素没有直接关系,其毒性作用可能主要与宿主肠道环境有关。本实验为研究CpA(β_2^+)在NEC中的影响提供初步实验依据。

产气荚膜梭菌β2毒素研究进展

产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌之一,该菌可以产生15种以上的毒素,α、β、ε、ι毒素、肠毒素及β2毒素等被认为是主要致病性毒素,其中β2毒素被推测在该病致病过程中起着重要作用。近年来,国内外对β2毒素的研究正在逐步深入和完善。论文就产气荚膜梭菌β2毒素的分子结构特征、生物学特征、致病性及免疫原性等方面的研究进展进行论述。

产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

为研究产气荚膜梭菌α、β、ε3种主要外毒素的免疫原性,构建基因亚单位多价疫苗,本研究通过PCR分别扩增α-β2及ε3种毒素基因,分别克隆于p Pro HTa载体中构建重组表达质粒p Pro-α-β2-ε,并转化大肠杆菌进行这3个目的基因的融合表达。SDS-PAGE分析显示,表达的α-β2-ε毒素融合蛋白大小约90 ku,主要以包涵体形式存在。将其免疫BALB/c小鼠后,分别利用A型和B型产气荚膜梭菌强毒素对免疫鼠进行攻毒,并测定免疫鼠血清中抗体对毒素的中和活性。结果表明,免疫鼠对A型和B型产气荚膜梭菌毒素1 LD100和2 LD100的攻毒保护率分别为100%和60%以及100%和80%。体外中和试验显示,免疫鼠血清稀释为1∶20时,对1 LD100A型和B型产气荚膜梭菌毒素的中和效率均可达到100%。以上结果表明,本研究制备的α-β2-ε融合蛋白具有良好的免疫原性,能够有效刺激机体产生中和抗体,可以作为基因工程疫苗的有效组分,为产气荚膜梭菌多价候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。

A型产气荚膜梭菌β2毒素蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法,本研究将产气荚膜梭菌β2毒素蛋白进行原核表达,用纯化的重组β2毒素蛋白作为包被抗原,建立了检测产气荚膜梭菌β2毒素抗体的间接ELISA方法。结果显示:该方法可以特异性地检测产气荚膜梭菌β2毒素抗体,与大肠杆菌、沙门菌和流行性腹泻病毒等常见猪腹泻病原的抗体均无交叉反应,并具有良好的灵敏度和重复性。本研究成功建立了特异性强、敏感性高以及重复性好的产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法,为产气荚膜梭菌的流行病学调查以及疫苗接种后β2毒素抗体水平监测提供可靠的技术支持,同时也有助于产气荚膜梭菌β2毒素致病机制的研究。

牛产气荚膜梭菌分离株毒素基因的检测与分析

为了解黑龙江省牛源产气荚膜梭菌分离株的基因型,检测β2和CPE两种次要毒素因子在牛源产气荚膜梭菌分离株中的携带情况。通过PCR方法检测了产气荚膜梭菌13个野毒株的cpa、cpb、etx、itx四种分型毒素、cpb2、cpb2的两个等位基因突变体(atypical cpb2和consensus cpb2)及肠毒素(cpe)基因。结果表明:92.3%(12/13)的产气荚膜梭菌分离株为A型,检测到1株D型;A型菌中β2毒素基因检出率为66.7%(8/12);β2毒素基因阳性菌株中75%(6/8)携带非典型cpb2基因,50%(4/8)携带典型cpb2基因,非典型突变体占优势。动物致病性试验发现β2毒素阳性菌株(8株)与β2毒素基因阴性菌株(4株)各有2株分离株具有致病性。所有菌株CPE毒素基因PCR检测均为阴性。研究为产气荚膜梭菌病的发病机理和疫苗开发提供了理论依据。

不同的透析器和透析方式对血透患者中小分子毒素清除效果的观察

目的比较单次中、高通量透析器血液透析和血液透析滤过对患者血清β2-微球蛋白(β2-MG)及小分子毒素的清除效果。方法选择我院维持性血液透析3个月以上的70例患者,根据使用透析器的不同和透析方式的不同,随机将这些患者分成4组:B1-1.6H(日本东丽PMMA膜)中通量透析组,F7HPS(费森尤斯聚砜膜)中通量透析组,FX60(Helixone)高通量透析组,APS900(ASAHI聚砜膜))透析滤过组;所有患者均使用动静脉内瘘透析,每周透析3次,每次4h,透析前后检测血生化、血红蛋白和β2-微球蛋白,观察单次透析对血清β2-微球蛋白、肌酐、尿素、磷清除效果。结果 4组患者在年龄、性别、透析龄、有无糖尿病、体质指数等资料和各项透析前化验指标无显著性差异;单次透析后,在B1.6H组、F7组、FX60组和APS900组,尿素下降率分别是66.9%,68.8%,68.2%和68.0%;肌酐下降率是63.3%,66.2%,63.2%和62.5%;磷的下降率是48.6%,54.4%,53.2%和53.3%,4组间尿素、肌酐和血磷的下降率无显著性差异;KT/V值分别是1.30,1.38,1.36和1.34,4组间也无显著性差异。单次透析后血清β2-微球蛋白降低率在APS900组最高,其次是FX60和B1-1.6H组,3组分别是77.7%,50.3%和29.8%;F7HPS组透析后血β2-微球蛋白增高15.4%;各组间均有显著性差异。结论中、高通量透析和血液透析滤过对小分子毒素清除效果相当;除血液透析滤过有效清除β2-微球蛋白以外,高通量透析以及PMMA膜的中通量透析器透析也能显著地降低β2-微球蛋白的浓度。

多种动物源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性

【目的】研究猪源及其它动物源A型产气荚膜梭菌(CpA)的β2毒素基因和相关生物学特性。【方法】从南昌周边地区随机采集猪、牛、羊、鸡、犬、鱼的新鲜粪便样品,采用4%D-环丝氨酸FTG梭菌选择培养基从各样品中分离纯化产气荚膜梭菌,并对分离菌株进行培养特性观察、革兰氏染色镜检、生化鉴定和16S rDNA分子鉴定;再通过多重PCR技术进行分子分型,对分离到的A型产气荚膜梭菌(CpA)进行β2毒素基因检测和溶血试验。【结果】所分离到的CpA中,除犬源CpA,其它动物源分离株均携带β2毒素基因;不同动物源的CpA溶血时间和溶血强度不一样:羊源CpA在血平板上4 h能观察到明显的溶血,溶血圈直径达到30 mm;猪源CpA 6 h才能观察到明显的溶血,溶血圈直径约为14 mm。【结论】为了解CpA致病机理,解析其在不同动物致病强弱和地区特异性提供参考依据。

肾康栓联合尿毒清改善腺嘌呤造模慢性肾衰竭SD大鼠肾功能探索

目的观察肾康栓肛门给药联合口服尿毒清颗粒对于口服腺嘌呤造模慢性肾衰竭雄性SD大鼠肾功能的改善作用。方法慢性肾衰竭SD雄性大鼠模型由腺嘌呤悬浊液200 mg/(kg·d)灌胃制备。以尿毒清颗粒作为口服途径对照药物。实验分组为联合用药组、肾康栓组、尿毒清组、模型组(造模后予以纯净水灌胃即安慰剂组)、空白组(未造模)。肾康栓组予以肾康栓隔日一次1/3粒(1. 0 g)送入肛门+纯净水15 mL/kg日一次灌胃。联合用药组予以肾康栓隔日一次1/3粒(1. 0g)送入肛门+尿毒清颗粒纯净水溶液15 mL/kg每日一次灌胃。尿毒清组予以尿毒清颗粒纯净水溶液15 mL/kg每日一次灌胃+纯净水13 mL/L隔日一次灌肠。模型组及空白组均予以纯净水15 mL/kg每日一次灌胃+纯净水13 mL/kg隔日一次灌肠。给药周期持续14 d,届时将于眼静脉取静脉血、肾组织、空肠组织作为标本,将实验SD大鼠血清中的血肌酐(SCR)尿素氮(BUN)尿素(UA)血β2微球蛋白(β2-MG)血清白蛋白(ALB)肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平以及肾组织URAT1和空肠组织ABCG2的表达水平作为观察指标。结果①肾康栓组和联合用药组SCR、BUN、UA、TNF-α较尿毒清组及模型组呈明显低值,(P <0. 05),而肾康栓组与联合用药组之间无统计学差异。②联合用药组β2-MG水平明显低于肾康栓组、尿毒清组及模型组(P <0. 05)但肾康栓组、尿毒清组及模型组之间并不存在统计学差异(P> 0. 05)。③肾康栓组、联合用药组、尿毒清组及模型组各组之间均不存在ALB差异(P> 0. 05)。④肾康栓组和联合用药组肾组织URAT1蛋白表达明显低于尿毒清组及模型组(P <0. 05)。而肾康栓组与联合用药组之间、尿毒清组与模型组之间均不存在统计学差异(P> 0. 05)。⑤联合用药组、肾康栓组、尿毒清组及模型组之间空肠ABCG2均无统计意义的差异(P> 0. 05)。结论肾康栓可通过肠系膜毛细血管吸收后实现其化瘀消浊的改善肾功能效用。具化体现为:消除尿液中小分子毒素、抑制炎症因子活动、加速尿酸排出三个方面。

仔猪粪便DNA中产气荚膜梭菌主要毒素基因检测及荧光定量PCR计数方法的建立

为探究产气荚膜梭菌(Cp)及其产生的β2毒素对7日龄内仔猪腹泻的影响,本试验利用PCR技术对江西不同地区96份仔猪粪样DNA进行分析。首先检测产气荚膜梭菌α、β、β2、ε、ι、CPE毒素基因来推断Cp存在和基因型,然后对不同地区的β2毒素基因全长进行测序比对、MEGA7构建进化树,最后采用荧光定量PCR对携带CpA(β2+)的健康、腹泻样品中的Cp菌数进行测定。结果显示:α毒素基因在健康、腹泻仔猪的检测率分别为85.4%(41/48),81.3%(39/48),β2毒素基因则分别为79.2%(38/48),77.1%(37/48);β、ε、CPE及ι毒素基因未能检测到,综合各分型毒素检测结果,阳性粪样存在的Cp均为A型。β2基因全长除九江地区得到的β2基因在第706～733bp缺失28个碱基,其他地区β2全长序列不多于3个碱基的差异,与GenBank登录号AJ537530.1对应序列同源性最高。携带CpA(β2+)的健康、腹泻粪样同浓度DNA中Cp菌数为104～105 CFU,经SPSS17分析,差异不显著(P>0.05)。结果表明,江西地区的猪源β2毒素基因保守性较高,但仔猪腹泻与β2毒素基因存在与否和Cp菌数没有明显的相关关系,是否与毒素表达有关有待进一步的研究,本试验结果为研究Cp致病机制提供了依据。