高表达抗β2糖蛋白I(β2GPI)自身抗体可加重结缔组织病炎症程度及免疫功能紊乱

目的 观察抗β2糖蛋白I(β2GPI)自身抗体在结缔组织病表达及其与炎症及免疫功能的关系。方法 观察对象为广义结缔组织病患者,包括结缔组织病(CTD)、类风湿性关节炎(RA)、干燥综合征(SS)和系统性红斑狼疮(SLE)。采用化学发光法进行定量检测抗β2GPI。采用魏氏法检测血沉(ESR),采用全自动生化分析仪检测C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)和抗环瓜氨酸多肽(CCP)抗体。结果 RA患者抗β2GPI抗体及其亚型较CTD、 SS、 SLE患者均明显升高。结缔组织病患者中CRP与抗β2GPI抗体、抗β2GPI抗体IgM呈正比。ESR与抗β2GPI抗体呈正比。与CRP正常组比较,CRP异常组抗β2GPI抗体、抗β2GPI抗体IgM升高。与ESR正常组比较,ESR异常组抗β2GPI抗体、抗β2GPI抗体IgG升高。RA患者中抗β2GPI抗体与ESR、抗CCP抗体呈正相关。抗β2GPI抗体IgG与RF呈正相关。结论 抗β2GPI抗体水平可作为结缔组织病炎症程度和评估免疫紊乱的一个预测因子。

双嘧达莫与低分子肝素对肾病综合征患儿凝血功能、肾功能、内皮功能及β_(2)糖蛋白Ⅰ/氧化低密度脂蛋白复合物的影响

目的 研究双嘧达莫与低分子肝素对肾病综合征患儿凝血功能、肾功能、内皮功能及β_(2)糖蛋白Ⅰ(β_(2)-GPⅠ)/氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)复合物的影响。方法 选取广西中医药大学第一附属医院2021年4月至2022年6月收治的90例肾病综合征患儿,按照随机数字表法将其分为对照A组(30例)、对照B组(30例)和观察组(30例)。对照A组给予甲泼尼龙+低分子肝素治疗,对照B组给予甲泼尼龙+双嘧达莫治疗,观察组行甲泼尼龙+低分子肝素+双嘧达莫治疗,三组均连续治疗30 d。比较三组治疗效果;比较三组治疗前后凝血功能指标[凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(D-D)],肾功能指标[尿素氮(BUN)、胱抑素C(CysC)、血肌酐(Scr)、24 h尿蛋白定量],内皮功能指标[内皮素1(ET-1)、血管性血友病因子(v WF)]及β_(2)-GPⅠ/ox-LDL复合物;观察组三组不良反应发生情况。结果 观察组与对照A组疗效比较,差异无统计学意义(P>0.05);观察组疗效优于对照B组(P<0.05)。治疗后,观察组APTT、PT水平长于对照A组和对照B组(P<0.05)。治疗后,观察组D-D、FIB、BUN、Cys C、Scr、24 h尿蛋白定量、ET-1、vWF、β_(2)-GPⅠ/ox-LDL复合物水平低于对照A组和对照B组(P<0.05)。观察组与对照A组不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05);观察组与对照B组不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 双嘧达莫联合低分子肝素可提高肾病综合征患儿临床疗效,改善凝血功能及肾功能,且用药安全性高。

重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析

目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。

血清正五聚蛋白3、富亮氨酸α-2-糖蛋白1水平变化与尖锐湿疣复发的关系

目的探讨血清正五聚蛋白3(PTX3)、富亮氨酸α-2-糖蛋白1(LRG1)水平变化与尖锐湿疣(CA)复发的关系。方法选取2020年1月至2022年1月武汉市第一医院收治的120例CA患者(CA组)作为研究对象。根据患者治疗后复发情况进一步分为复发组(n=64)和无复发组(n=56)。选取同期健康体检者120例设为对照组。采用酶联免疫吸附试验法检测血清PTX3、LRG1水平。采用多因素Logistic回归分析CA患者复发的影响因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清PTX3、LRG1及其联合对CA患者复发的预测效能。结果CA组PTX3、LRG1水平显著高于对照组(P<0.05)。与无复发组比较,复发组熬夜、避孕套使用、性伴侣人乳头瘤病毒(HPV)感染人数及白介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)、PTX3、LRG1水平显著较高(P<0.05)。Logistic分析结果显示,IL-6、IL-1β、TNF-α、CRP、PTX3、LRG1均是CA复发的独立危险因素(P<0.05)。CA患者血清PTX3与LRG1呈正相关(r=0.680,P<0.05),PTX3与IL-6、IL-1β、TNF-α、CRP呈正相关(r=0.587、0.523、0.592、0.566,P<0.05),LRG1与IL-6、IL-1β、TNF-α、CRP呈正相关(r=0.547、0.508、0.559、0.531,P<0.05)。ROC曲线结果显示,血清PTX3、LRG1水平及二者联合预测CA复发的曲线下面积(AUC)分别为0.742、0.795、0.878,其中联合预测的AUC显著高于二者单独预测(Z=2.490、1.615,P<0.05)。结论CA患者血清PTX3、LRG1水平显著上升,其可增加CA复发的风险,均可作为CA复发的预测因子。

牛血中β2-糖蛋白的提取纯化及免疫原性研究

【目的】为β2GPI的获得增加一个新的途径,提高牛血的利用效益,减少牛血资源浪费。【方法】牛血清经HClO_(4)沉淀、Heparin Sepharose CL-6B亲和层析及分子筛等方法纯化获得目的蛋白β2GPI。利用凝胶电泳技术对提取的Bβ2GPI进行了纯度鉴定和分析,然后采用ELISA技术对Bβ2GPI的免疫原性进行了评估。【结果】试验表明提取纯化的Bβ2GPI纯度约为95%,其反应性与β2GPI标准品相同。【结论】从牛血中成功提取纯化β2GPI,且所获得的蛋白具有较高纯度和良好的免疫原性。

SARS-CoV-2刺突糖蛋白对神经细胞的损伤效应及机制

目的探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突糖蛋白(S蛋白)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的损伤效应及其机制。方法用S蛋白0(细胞对照组),25,50,75和100 mg·L^(-1)处理SH-SY5Y 24 h,CCK-8法检测细胞活力;比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率;EdU试剂盒检测细胞增殖;荧光素酶发光法检测细胞内ATP含量;JC-1荧光探针法检测细胞线粒体膜电位(MMP);Seahorse XF检测细胞糖酵解及线粒体氧化磷酸化水平。结果与细胞对照组相比,S蛋白25,50,75和100 mg·L^(-1)组细胞活力显著降低(P<0.01),半数抑制浓度(IC_(50))为65.05 mg·L^(-1);LDH释放率显著增加(P<0.01);EdU阳性细胞比例显著降低(P<0.01);S蛋白75和100 mg·L^(-1)组细胞内ATP含量显著降低(P<0.01);S蛋白50和75 mg·L^(-1)组细胞内MMP显著降低(P<0.05,P<0.01);S蛋白50 mg·L^(-1)组基础糖酵解水平和糖酵解能力的最大值显著升高(P<0.05,P<0.01),S蛋白25和50 mg·L^(-1)组呼吸能力最大值显著升高(P<0.05,P<0.01)。SH-SY5Y细胞活力与细胞内ATP含量和MMP均呈正相关(r^(2)=0.9209,P=0.001;r^(2)=0.6170,P=0.0025);与反映细胞糖酵解水平的细胞基础糖酵解水平和糖酵解能力最大值呈负相关(r^(2)=0.5194,P=0.0285;r^(2)=0.6664,P=0.0073),与反映线粒体氧化磷酸化水平的ATP生成能力呈负相关(r^(2)=0.8204,P=0.0008)。结论S蛋白使SH-SY5Y细胞活力下降,抑制细胞增殖,其机制可能与干扰神经细胞内能量代谢密切相关。

血清富亮氨酸α_(2)糖蛋白1、新蝶呤与病毒抗体检测对病毒性脑膜炎患儿病情评估及预后预测的价值

目的探讨血清富亮氨酸α_(2)糖蛋白1(LRG1)、新蝶呤(NPT)与病毒抗体交互作用在病毒性脑膜炎(VM)患儿病情进展中的作用及其对VM患儿病情评估及预后预测的价值。方法选择2020年8月至2023年2月开封市儿童医院收治的130例VM患儿为观察组,另选择同期收治的130例有VM症状但经腰椎穿刺脑脊液检查确诊为非中枢系统感染性疾病患儿为对照组。入院后采集2组患儿2 mL外周静脉血,采用酶联免疫吸附法检测血清LRG1、NPT水平;治疗前行腰椎穿刺,采集1 mL脑脊液标本,采用酶联免疫吸附法检测脑脊液中单纯疱疹病毒Ⅰ(HSV-Ⅰ)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、副流感病毒(PIV)的特异性IgG抗体。比较2组患儿的血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率。依据病情严重程度将VM患儿分为轻症组(n=76)和重症组(n=54),依据治疗2周后的预后将VM患儿分为预后良好组(n=37)和预后不良组(n=93);比较不同病情严重程度组、不同预后组患儿血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率,分析血清LRG1、NPT和病毒抗体与VM患儿病情严重程度、病情进展的相关性,并分析其对VM患儿病情进展的交互作用,采用受试者操作特征(ROC)曲线分析血清LRG1、NPT与病毒抗体对VM患儿预后的预测价值。结果观察组患儿血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率均显著高于对照组(P<0.05);重症组患儿血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率均显著高于轻症组(P<0.05);预后不良组患儿血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率均显著高于预后良好组(P<0.05)。高血清LRG1水平与高病毒抗体IgG阳性率、高血清NPT水平与高病毒抗体IgG阳性率导致VM患儿预后不良中呈正向交互作用(比值比:15.238、9.684);血清LRG1高表达与高病毒抗体IgG阳性率(比值比:15.238)、血清NPT高表达与高病毒抗体IgG阳性率(比值比:9.684)为次相乘模型。血清LRG1、NPT水平与病毒抗体IgG阳性率预测治疗2周VM患儿预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.786、0.794、0.919,三者联合预测的AUC为0.933;LRG1、NPT与病毒抗体IgG阳性率联合预测治疗2周VM患儿预后不良的AUC大于三者单独预测(P<0.05)。结论NPT、LRG1可能参与了VM的发生发展,血清NPT、LRG1水平与VM患儿病情严重程度、病情进展均呈正相关,血清NPT、LRG1水平及病毒抗体IgG阳性率对VM的病情评估及预后预测有一定价值,且三者联合对VM预后的预测价值更高;VM患儿高LRG1与高病毒抗体IgG阳性率、高NPT与高病毒抗体IgG阳性率同时存在时具有正向交互作用。

重组糖蛋白激素β5/α2调控cAMP/PKA/CREB通路促进3T3-L1细胞脂肪分解的作用及机制研究

目的研究重组糖蛋白激素β5/α2(rCGH)对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响,并探究其潜在机制。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导分化为成熟脂肪细胞,给予不同浓度rCGH干预24 h。以CCK-8法检测3T3-L1脂肪细胞的细胞活力,酶学方法测定细胞内甘油三酯(TG)及培养上清中甘油的水平,油红O染色观察脂滴变化。Western blot检测各组脂肪细胞中HSL和ATGL脂解蛋白的表达水平。不同浓度rCGH加或不加PKA抑制剂H89对已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞进行联合干预实验,将培养细胞分为对照组、H89预处理组、1μmol·L^(-1)rCGH组和(1μmol·L^(-1)rCGH+H89)联合干预组。酶法测定胞内TG及游离甘油的含量,Western blot检测CREB及脂解相关蛋白的表达。结果不同浓度rCGH(0.25、0.5、1、2μmol·L^(-1))对脂肪细胞细胞活力无显著影响(P>0.05);与对照组相比,rCGH处理显著降低了脂滴大小和细胞内TG含量,同时显著升高了细胞上清液中的甘油浓度。rCGH处理还刺激了p-HSL、ATGL和p-PKA的蛋白表达。此外,加入PKA抑制剂H89,减弱了rCGH对游离甘油水平、细胞内TG含量以及p-HSL、p-PLIN1和p-CREB表达的影响。结论rCGH通过上调HSL、ATGL和PKA活性促进3T3-L1脂肪细胞的脂质分解,促进甘油释放,抑制TG合成和脂质积累,其作用机制与cAMP/PKA/CREB信号通路激活有关。

tau蛋白、胶质纤维状酸性蛋白及抗β2糖蛋白1抗体水平与高血压脑出血患者预后的相关性分析

目的分析tau蛋白、胶质纤维状酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2 glycoprotein 1 antibody,aβ2-GP1)水平与高血压脑出血(hypertensive intracerebral hemorrhage,HICH)患者预后的相关性。方法将70例HICH患者纳入研究组,另将同时期进行健康体检的70例人员纳入对照组。比较两组tau蛋白、GFAP以及aβ2-GP1水平。比较不同预后HICH患者tau蛋白、GFAP、aβ2-GP1水平和美国国立卫生院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)评分;并分析HICH患者相关指标与NIHSS评分的相关性。使用受试者工作特征(receiver operation characteristic,ROC)曲线分析相关指标预测HICH患者不良预后的临床价值。结果与对照组比较,观察组tau蛋白、GFAP以及aβ2-GP1水平均较高(P<0.05)。预后不良的HICH患者tau蛋白、GFAP、aβ2-GP1水平和NIHSS评分均较高(P<0.05);相关指标与NIHSS评分均呈正相关(均P<0.05)。相关指标预测HICH患者预后不良的最佳临界值:tau蛋白≥258.15ng/L、GFAP≥16.15ng/L、aβ2-GP1≥18.35 RU/mL,此时ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.908(95%CI:0.828~0.988,P<0.05)、0.871(95%CI:0.781~0.961,P<0.05)、0.839(95%CI:0.728~0.949,P<0.05),敏感度为77.27%、77.27%、72.73%,特异度为97.92%、85.42%、89.58%。结论HICH患者tau蛋白、GFAP以及aβ2-GP1水平较高,神经损伤较重、预后不良的HICH患者相关指标更高,监测HICH患者tau蛋白、GFAP以及aβ2-GP1水平可用于不良预后的评估。

基于重组牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2的间接ELISA检测方法建立

为建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的间接ELISA方法,本试验将纯化后的重组BVDVE2蛋白作为抗原包被96孔酶标板,采用方阵滴定法优化间接ELISA的各项反应参数初步建立检测方法,并进一步分析了该方法的特异性、敏感性和重复性。确定的最佳ELISA反应条件如下:抗原包被浓度为1.5μg/mL,1:100稀释待检血清于37℃孵育1 h,1:6 000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG于37℃作用1 h,确定阴、阳性血清临界OD450 nm值分别为0.203和0.226。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与商品化试剂盒的检测符合率达96%,该方法可以用于BVDV抗体的检测和试剂盒的进一步研制。

抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗β_(2)糖蛋白Ⅰ抗体在复发性流产中的表达及预测价值研究分析

目的分析抗心磷脂抗体(ACA)、抗核抗体(ANA)、抗β_(2)糖蛋白Ⅰ抗体(β_(2)-GPⅠ)在复发性流产中的表达及预测价值,为临床复发性流产疾病的诊断与防治提供充足的理论支持。方法回顾性分析2019年12月至2022年12月徐州和平妇产医院收治的80例复发性流产后再次妊娠孕妇的临床资料,将其作为研究组,同期回顾性分析80例体检健康孕妇的体检资料,将其作为对照组,比较对照组和研究组研究对象,以及研究组不同病情严重程度患者组间ANA、ACA-IgG、抗β_(2)-GPⅠ表达水平;采用多因素Logistic回归分析模型分析复发性流产的影响因素,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析模型对复发性流产的预测价值。结果研究组ANA及ACA-IgG、抗β_(2)-GPⅠ水平均高于对照组;重度复发性流产患者ANA及ACA-IgG、抗β_(2)-GPⅠ水平均高于轻度复发性流产患者;多因素Logistic回归分析显示,ANA、ACA-IgG、抗β_(2)-GPⅠ高表达均为复发性流产的危险因素;ROC结果显示,ANA、ACA-IgG、抗β_(2)-GPⅠ及3者联合检测在复发性流产中的预测的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.886、0.937、0.888、0.946,且3者联合检测的AUC最大(均P<0.05)。结论ANA、ACA-IgG、抗β_(2)-GPⅠ水平同复发性流产密切相关,联合ANA、ACA-IgG、抗β_(2)-GPⅠ检测对复发性流产患者的临床诊断价值更高。

抗IgG、IgM、IgA型心磷脂抗体和抗β_2糖蛋白1抗体在系统性红斑狼疮患者中的意义

目的探讨抗IgG、IgM、IgA型心磷脂抗体和抗β2糖蛋白1抗体在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者中的意义。方法分别采用化学发光免疫分析法和酶联免疫吸附法检测372例SLE患者、80例其他结缔组织病患者及60例健康体检者血清中抗IgG、IgM、IgA型心磷脂抗体和抗β2糖蛋白1抗体。同时分析这4个指标与SLE及其病情严重程度的相关性。结果在检测的372例SLE患者组中,抗IgG、IgM、IgA型心磷脂抗体和抗β2糖蛋白1抗体的阳性率分别为31.45%、14.52%、10.22%和29.03%,其表达水平分别为(90.39±35.43)U/ml、(41.25±23.16)U/ml、(32.27±15.77)U/ml、(61.42±21.69)U/ml,与SLEDAI积分呈正相关(P<0.05)。在80例疾病对照组中,抗IgG、IgM、IgA型心磷脂抗体和抗β2糖蛋白1抗体的阳性率分别为7.50%、2.50%、0和1.25%。而在60例正常对照组中,4项检测结果均为阴性。抗IgG型心磷脂抗体阳性与血小板减少、白细胞减少、血栓形成、习惯性流产和肾脏病变有关;抗IgM型心磷脂抗体阳性与血小板减少、白细胞减少、血栓形成和肾脏病变有关;抗IgA型心磷脂抗体阳性与血小板减少、血栓形成和肾脏病变有关;抗β_2糖蛋白1抗体阳性与血小板减少、白细胞减少、溶血性贫血、血栓形成、习惯性流产和肾脏病变有关。结论抗IgG、IgM、IgA型心磷脂抗体和抗β_2糖蛋白1抗体在SLE的发病及病情发展中起到了非常重要的作用,定量和联合检测对SLE的诊断、病情严重程度的评价、判断预后及疗效观察等均有重要的临床意义。

抗β_2糖蛋白Ⅰ抗体诱导血液单核细胞表达组织因子活性的机制探讨

目的:探讨抗β2糖蛋白Ⅰ(抗β2GPⅠ)抗体诱导血液单核细胞表达组织因子(TF)活性的机制。方法:利用纯化的抗磷脂综合征(APS)患者血清IgG、单克隆抗β2GPⅠ抗体、抗Annexin A2抗体等刺激血液单核细胞及单核细胞株,通过凝血因子Ⅹa的生成量,判断细胞TF活性的表达;利用W estern杂交技术检测单核细胞膜表面AnnexinA2的表达;采用免疫细胞化学染色判断单核细胞膜表面Annexin A2、β2GPⅠ、抗β2GPⅠ抗体的结合情况。结果:APS患者血清IgG和抗β2GPⅠ抗体显著增强单核细胞TF的表达;单核细胞膜表达的Annexin A2与β2GPⅠ/抗β2GPⅠ结合成复合物,引发细胞TF表达增强;抗Annexin A2抗体可抑制复合物的这种作用。结论:细胞表面Annexin A2介导β2GPⅠ/抗β2GPⅠ诱导单核细胞表达TF活性,是APS血栓形成的机理之一。

抗β_2-糖蛋白Ⅰ抗体与反复自然流产的关系

目的:探讨抗β2-糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β2-GPⅠantibody)与反复自然流产(RSA)的关系。方法:采用酶联免疫吸附法检测81例RSA患者和39例正常妇女血清中anti-β2-GPⅠ的水平。结果:RSA组anti-β2-GPⅠ及其IgG型抗体阳性率分别为42.0%和40.8%,显著高于对照组(7.7%)(P<0.01,P<0.05);IgM型抗体阳性率与对照组比较差异无显著性(P>0.05);早期与中晚期RSA两组间及RSA 2次与RSA≥3次两组间阳性率比较差异均无显著性(P>0.05)。结论:anti-β2-GPⅠ与RSA有关,可作为RSA免疫因素的辅助诊断指标。

氧化修饰的β_2-糖蛋白-1诱导抗心磷脂抗体的产生

目的：探讨蛋白质的氧化修饰与体内抗磷脂抗体产生的关系。方法：首先，在体外以次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化系统氧化大鼠β_2-GP1，然后以氧化的β_2-GP1（oxβ_2－GP1）免疫同种大鼠，最后以ELISA方法检测被免疫大鼠β_2-GP1血清中的抗心磷脂抗体（ACA）。结果：氧化的β_2-GP1免疫的大鼠血清中产生高滴度的ACA。结论：β_2－GP1的氧化修饰在ACA的产生上可能起十分重要的作用。

兔抗人β_2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备兔抗人β2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及功能活性。方法以纯化的人血浆β2糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)免疫新西兰大白兔,获得抗血清;利用Protein A及β2-GPI亲和层析柱纯化血清中总IgG和抗β2-GPI多克隆抗体;用免疫双向扩散试验(IDD)、ELISA和western-blot等方法鉴定抗体。结果IDD及ELISA鉴定抗体效价分别达到16和1×105;western-blot显示纯化的总IgG和抗β2-GPI抗体与β2-GPI蛋白均有特异反应条带;且抗体与β2-GPI复合物能够刺激单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)活性。结论成功获得并纯化兔抗人β2-GPI多克隆抗体,为进一步研究β2-GPI/抗β2-GPI复合物在抗磷脂抗体综合征血栓形成机制中的作用建立了基础。

人β_2糖蛋白1的重组表达及对抗磷脂抗体综合征患者血清诱导内皮细胞产生ICAM-1的影响

目的:探讨重组人β2糖蛋白1(hrβ2-GP1)对抗磷脂抗体综合征(APS)患者血清诱导内皮细胞系产生细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的影响。方法:应用pQE30表达载体表达hrβ2-GP1,Western blotting对重组蛋白进行鉴定;应用hrβ2-GP1处理前后的APS患者血清分别与内皮细胞株EA.hy926共孵育,细胞ELISA和RT-PCR方法分析处理前后EA.hy926表达ICAM-1的变化。结果:成功构建pQE30-hβ2-GP1,并对表达产物进行了纯化和鉴定,所获得的蛋白与预期的大小一致,并具有人β2-GP1的抗原性;rhβ2-GP1处理后的APS患者血清与处理前比较,与其孵育的内皮细胞系EA.hy926表达ICAM-1在蛋白和mRNA水平均明显降低,这种抑制作用随着rhβ2-GP1的浓度增加而逐渐增强。结论:抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2GP1)促进内皮细胞系EA.hy926表达ICAM-1,hrβ2-GP1可中和此作用。

β_2糖蛋白I纯化及其稳定性分析

目的:从正常人混合血浆中纯化获得β2糖蛋白Ⅰ(β2GPI),并对提纯蛋白的纯度及稳定性进行分析。方法:采用HClO4沉淀、Heparin Sepharose CL-6B亲和层析柱等纯化β2GPI;利用SDS-PAGE、蛋白质印迹分析提纯蛋白的纯度;观察不同温度、NaCl浓度及防腐剂等条件下的β2GPI稳定性。结果:本法获得了高纯度目的蛋白β2GPI(>95%)。β2GPI在浓度低于0.8 mol/L的NaCl溶液中,置室温及4℃保存易降解变性,但在1.6 mol/L NaCl溶液中于室温及4℃保存60天均未见蛋白明显降解。结论:利用本法能够得到高纯度的β2GPI,在使用和保存β2GPI时要考虑到其降解的可能性,注意保存条件,必要时冻干保存。

β_2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用

目的 利用人工合成β2糖蛋白1（β2GP1）多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体, 并鉴定抗体的特异性及致病性。方法 应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35~51位氨基酸的多肽, 将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联, 免疫新西兰大白兔制备抗血清, 蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体, 利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性。体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞一定时间, 收集细胞总RNA和总蛋白, 实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子（TF）mRNA和蛋白表达; Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65（NF-κB p65）及磷酸化NF-κB p65表达情况; 体内实验采用C3H/HeN小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征（EAPS）模型, 检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间（APTT）。结果 化学合成β2GP1多肽的纯度为94％, 达到免疫用抗原标准。偶联KLH后免疫新西兰大白兔, 其抗血清效价大于1∶32 000。Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带, 双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合。体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、 NF-κB p65磷酸化, 诱导细胞TF mRNA及蛋白表达。体内实验成功建立EAPS小鼠模型, 小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200, APTT明显缩短。结论 所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子, 能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应。