滋肾活血方对血管性痴呆大鼠分裂与融合蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1的影响

目的观察滋肾活血方对血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠海马组织线粒体融合蛋白1(mitofusin 1,Mfn1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2)、线粒体动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、线粒体分裂蛋白1(fission mitochondrial 1,Fis1)表达的影响。方法选用雄性SD大鼠60只,随机均分为假手术组、模型组、滋肾活血高剂量组、滋肾活血中剂量组、滋肾活血低剂量组、西药组。除假手术组外,其余各组均采用改良2-VO法建立VD大鼠模型。每组大鼠按9 mL/(kg·d)剂量灌胃相应药物。模型组、假手术组给予蒸馏水,滋肾活血低剂量组、滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组予以滋肾活血方溶液[9.8、17.8、35.6 g/(kg·d)]灌胃,西药组以多奈哌齐溶液[150 mg/(kg·d)]灌胃。连续喂药2周后,采用水迷宫实验评估大鼠学习记忆功能;取海马组织,采用免疫组化法检测实验大鼠海马组织中的Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1蛋白表达量。结果与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期(escape latency,EL)延长(P<0.05),Mfn1、Mfn2、Drp1蛋白的表达量降低(P<0.05)。与模型组对比,滋肾活血中、高剂量组大鼠EL缩短(P<0.05),Mfn1、Mfn2、Drp1蛋白表达量升高(P<0.05)。与滋肾活血低剂量组比较,滋肾活血中、高剂量组大鼠EL缩短(P<0.05),Mfn1、Drp1蛋白表达量升高(P<0.05)。结论滋肾活血方可能通过调节细胞内线粒体分裂与融合,上调Mfn1、Mfn2、Drp1蛋白的表达,从而改善认知功能。

融合蛋白接头linker在细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162-2(4)中的选择设计

目的:分析蛋白EgG1Y162-2通过不同长度接头序列连接后形成的肽段四聚体蛋白EgG1Y162-2(4)的氨基酸序列特征,明确其理化性质及三级结构,预测并对比经不同长度柔性接头连接后其优势抗原表位变化,为增强重组疫苗免疫原性选取最理想的linker序列。方法:利用生物信息学方法选择GSGGSG、GGGGSGGG和GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列进行连接设计EgG1Y162-2(4)重组蛋白疫苗。在线软件ProtParam分析其理化性质;SOPMA在线数据库对设计有不同linker序列的重组蛋白二级结构进行预测分析;I-TASSER在线软件预测所设计重组疫苗的三级结构,并使用SYFPEITHI、IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测。结果:经预测通过GSGGSG、GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列连接的EgG1Y162-2(4)均是稳定蛋白且具有亲水性并得到其二级结构特点。设计的重组疫苗EgG1Y162-2(4)通过生物信息学方法预测得知通过GSGGSG连接的EgG1Y162-2(4)中α螺旋占8.50%,β-转角占16.67%,无规则卷曲约占40.48%,延伸链约占34.35%,该蛋白有8个T/B联合表位,前后串联的EgG1Y162-2蛋白不仅能够正常折叠,且与EgG1Y162-2蛋白相比T/B抗原表位未发生偏移。三级结构显示通过linker序列GSGGSG串联的4个蛋白EgG1Y162-2均能正常表达,而通过GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG串联的蛋白EgG1Y162-2(4)表位发生了一定程度右移。结论:利用GSGGSG 6个氨基酸连接EgG1Y162-2蛋白构成的EgG1Y162-2(4)的T/B联合表位高度重合,表位未发生迁移说明蛋白EgG1Y162-2(4)通过这种方式连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白优势表位造成影响,并通过重复蛋白表位数增强疫苗免疫应答效果,制备有效的棘球蚴病表位疫苗。

尿α_1-微球蛋白、β_2-微球蛋白、IgG、微量白蛋白测定对诊断胰腺炎早期肾损害的意义

目的探讨尿α1-微球蛋白、β2-微球蛋白、IgG、微量白蛋白测定对诊断胰腺炎早期肾损害的意义。方法采用放射免疫分析法测定了10例正常对照者和25例水肿性胰腺炎、15例重症胰腺炎患者尿中的α1-微球蛋白、β2-微球蛋白、IgG、微量白蛋白,分析其与胰腺炎损伤程度的关系。结果重症胰腺炎组尿中α1-微球蛋白、β2-微球蛋白、IgG、微量白蛋白的浓度显著高于水肿性胰腺炎组和正常对照组。水肿性胰腺炎组尿中α1-微球蛋白、β2-微球蛋白、IgG、微量白蛋白与正常对照组无显著差异。结论尿中的尿α1-微球蛋白、β2-微球蛋白、IgG、微量白蛋白测定对诊断胰腺炎早期肾损害具有重要意义。

子宫内膜样腺癌组织NuSAP1、MFN2表达与临床病理特征和预后的关系

目的探讨子宫内膜样腺癌(EA)组织核仁纺锤体相关蛋白1(NuSAP1)、线粒体融合蛋白2(MFN2)表达与临床病理特征和预后的关系。方法选取2019年3月至2020年10月南阳市第一人民医院收治的121例EA患者作为研究对象,应用免疫组织化学染色法检测患者癌组织及其对应癌旁组织NuSAP1、MFN2阳性表达率,分析癌组织NuSAP1、MFN2阳性表达率与患者临床病理特征的关系。出院后随访3年,完成随访112例,应用Kaplan-Meier生存曲线分析NuSAP1、MFN2阳性表达组和阴性表达组的预后差异,应用多因素COX回归分析EA患者预后的影响因素。结果EA癌组织NuSAP1阳性表达率为72.37%,明显高于癌旁组织的35.54%,MFN2阳性表达率为38.02%,明显低于癌旁组织的80.17%,差异均有统计学意义(P<0.05);国际妇产科联盟(FIGO)临床分期Ⅱ~Ⅲ期、中低分化、有淋巴结转移、深肌层浸润癌组织中NuSAP1阳性表达率分别为88.68%、83.54%、96.15%、90.63%,明显高于FIGO临床分期Ⅰ期的60.29%、高分化的57.14%、无淋巴结转移的55.79%、浅肌层浸润癌组织的66.29%,差异均有统计学意义(P<0.05);FIGO临床分期Ⅱ~Ⅲ期、中低分化、有淋巴结转移、深肌层浸润癌组织中MFN2阳性表达率分别为18.87%、30.38%、7.69%、15.63%,明显低于FIGO临床分期Ⅰ期的52.94%、高分化的52.38%、无淋巴结转移的46.32%、浅肌层浸润癌组织的46.07%,差异均有统计学意义(P<0.05);Kaplan-Meier法分析结果显示,NuSAP1阴性表达组和MFN2阳性表达组患者的3年生存率分别为90.00%和87.80%,明显高于NuSAP1阳性表达组的69.51%和MFN2阴性表达组的67.61%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论EA患者组织中NuSAP1阳性表达率升高,MFN2阳性表达率降低,NuSAP1、MFN2表达水平与患者肿瘤分化、FIGO临床分期、淋巴结转移及深肌层浸润有关,且是患者死亡的危险因素,提示NuSAP1、MFN2可能参与了EA患者的疾病进展。

Mfn2通过Ras-Raf-ERK1/2信号通路抑制ARDS肺纤维化及其机制

目的探讨线粒体融合蛋白(Mfn)2通过细胞外信号调节激酶(Ras-Raf-ERK)1/2信号通路抑制急性呼吸窘迫综合征(ARDS)肺纤维化及其机制。方法离体培养人胚肺成纤维细胞(HELF),给予脂多糖(LPS)刺激建立ARDS细胞模型,构建腺病毒重组体Adv-Mfn21-264-GFP、Adv-Mfn2265-757-GFP、Adv-Mfn21-757-GFP,分别转染HELF,使其分别过表达Mfn2的N端GTP酶结构域(aa1-264)、C端跨膜区(aa265-757)及Mfn2的全长氨基酸残基(aa1-757),将细胞分为:Control组、Adv-vector组、LPS组、Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组;噻唑蓝(MTT)法观察各组HELF细胞增殖情况,并检测细胞内胶原蛋白的表达情况,Western印迹及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Ras信号通路Ras、Raf-1及ERK1/2的表达。结果Control组与Adv-vector组细胞增殖水平无明显差异(P>0.05);与Control组比较,LPS组第2、3、4、5、6天细胞增殖水平均明显增加(P<0.01);转染不同Mfn2基因片段后,与LPS组比较,Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组肺成纤维细胞增生受到抑制,细胞增殖水平明显下降(P<0.01);且LPS组较Control组细胞内胶原蛋白含量明显增加,Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组较LPS组细胞内胶原蛋白含量明显减少(均P<0.01);Western印迹及RT-PCR检测结果显示,与Control组比较,LPS组Ras、Raf-1、ERK1/2蛋白及基因表达明显增加,而转染不同Mfn2基因片段腺病毒后,与LPS组比较,Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组Ras、Raf-1、ERK1/2蛋白及基因表达明显下调(均P<0.05)。结论Mfn2可能通过N端GTP酶结构域、C端跨膜区调控Ras-Raf-ERK1/2信号通路影响成纤维细胞异常增殖抑制ARDS肺纤维化。

C型产气荚膜梭菌α、β_1、β_2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kbα-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol?L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。

AML1-ETO融合蛋白对BCL-2基因表达的影响

本研究旨在观察AML1-ETO在白血病细胞中对于抗凋亡基因BCL-2表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937-WT、U937-Mock和经AML1-ETO基因转染的U937-A/E1-4的细胞凋亡率;使用免疫印迹法检测cleaved caspase-3蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测转染细胞和对照组细胞以及AML-M2患者白血病细胞BCL-2 mRNA的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与BCL-2基因启动子之间直接的相互作用情况。结果表明:AML1-ETO转染细胞的凋亡率明显增加,且检测到cleaved caspase-3蛋白的表达;转染了AML1-ETO的U937细胞系和具有AML1-ETO融合基因的AML-M2患者中,BCL-2的mRNA表达水平显著下调;转染细胞沉淀富集的AML1-ETO直接结合的DNA中含有BCL-2基因的启动子序列。结论:BCL-2是AML1-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调BCL-2的表达。

人KIR2DL1-Ig融合蛋白在COS-7细胞的表达

目的 :获得人KIR2DL1分子 (killerIg likereceptor 2DL1)胞外区与人IgGFc段的融合蛋白。方法 :从人外周血单个核细胞中提取总RNA ,通过RT PCR扩增编码KIR2DL1胞外段cDNA ,经NheⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,定向插入真核细胞表达载体CD5lnegl中。构建的重组真核表达载体CD5lnegl KIR2DL1。经酶切分析和测序鉴定后 ,通过DEAE dextran/chloroquine法转染COS 7细胞。瞬时表达后 ,取培养上清液经亲和层析、ELISA、SDS PAGE及Western印迹 ,鉴定融合蛋白的表达及其免疫学活性。结果 :序列测定证实 ,该重组表达载体含有正确的KIR2DL1胞外区基因序列。重组真核表达载体CD5lnegl KIR2DL1转染COS 7细胞后 ,ELISA法检测细胞培养上清中有融合蛋白的表达。SDS PAGE结果显示 ,该融合蛋白的相对分子质量 (Mr)约为 730 0 0。Western印迹结果证实 ,该蛋白能被特异性单克隆抗体 (mAb)EB6所识别。结论 :KIR2DL1 Ig融合蛋白表达载体成功构建并在COS 7细胞中获得功能性表达 。

出血性大肠杆菌O157 Eae-Stx1/2B融合蛋白的免疫学特性

为了研究重构融合蛋白Eae-Stx1/2B免疫特性及对出血性大肠杆菌感染的免疫保护作用,进行了细胞粘附抑制试验和免疫保护试验。结果证明Eae-Stx1/2B融合蛋白免疫血清在体外能降低出血性大肠杆菌对HEp-2细胞的粘附作用,这一特性在出血性大肠杆菌疫苗设计中具有重要价值。以纯化的融合蛋白Eae-Stx1/2B为抗原对小鼠进行腹腔注射免疫和滴鼻免疫,ELISA检测结果显示,2次免疫后7 d,免疫组抗Eae-Stx1/2B融合蛋白和抗出血性大肠杆菌O157血清IgG抗体显著高于未免疫组;用出血性大肠杆菌O157强毒株EDL933攻击免疫小鼠,免疫组小鼠排菌时间显著缩短,免疫组小鼠存活率均高于未免疫组,免疫组小鼠体质量恢复增长较快。上述试验结果表明,Eae-Stx1/2B融合蛋白对出血性大肠杆菌感染有保护作用。

突触融合蛋白1A与2型糖尿病

突触融合蛋白 1A属于突触前膜受体 ,参与突触小泡膜与突触前膜的融合及神经递质释放 ,传递神经信息。近年研究表明 ,突触融合蛋白 1A也存在于胰岛 β细胞膜及微粒体膜上 ,参与钙依赖性的胰岛素分泌 ,影响含胰岛素的分泌颗粒胞吐 ;对 2型糖尿病的动物模型和患者研究显示突触融合蛋白 1A与

脑缺血大鼠脑组织中发动蛋白相关蛋白1和线粒体融合基因2的动态表达

目的:探讨脑缺血后线粒体分裂蛋白及融合蛋白表达水平的变化。方法:72只大鼠随机分为脑缺血后组及假手术组,每组18只。采用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线栓塞大脑中动脉建立脑缺血模型。应用苏木精-伊红染色(HE染色)观察大脑皮质神经元形态结构,蛋白免疫印迹法检测脑组织Drp1及Mfn2的蛋白含量,rt-PCR检测Drp1及Mfn2的mRNA基因的表达情况。结果:脑缺血组的Drp1蛋白及其mRNA基因的表达明显高于假手术组,且随着时间的延长表达逐渐增加(P<0.01);脑缺血组Mfn2蛋白及其表达mRNA基因的表达低于假手术组,且随着时间的延长表达逐渐减少(P<0.01)。结论:线粒体分裂和融合蛋白表达异常可能是脑缺血后脑组织损伤的重要机制。

mTSLP-V1/V2融合蛋白的真核表达与鉴定

目的:将鼠胸腺基质淋巴细胞生成素(mouse thymic stromal lymphopoietin,mTSLP)与人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)B亚型分离株BAL的gp120 V1/V2结构域在293F真核细胞表达体系中进行融合表达。方法:以真核表达质粒pCEP-Pu为载体,构建mTSLP与gp120BALV1V2融合基因的重组蛋白表达质粒pCTV1V2BAL。限制性酶切电泳与测序验证质粒构建正确后,使用PEI瞬时转染293F悬浮细胞,表达产物以SDS-PAGE与Western blot进行分析,并对纯化后重组蛋白的V1/V2抗原表位进行了ELISA分析。结果:SDS-PAGE、Western blot分析显示,在表观分子量35 kD至55 kD的范围内存在一条不均一的糖蛋白条带,并且能与抗mTSLP多克隆抗体和抗His标签单克隆抗体发生反应。HIV-1阳性病人血清能够识别mTSLP-V1/V2BAL上的HIV-1V1/V2抗原表位。结论:在293F中成功表达了mTSLP-V1/V2BAL融合蛋白,该蛋白具有HIV-1gp120BALV1/V2区的抗原表位,能够用于HIV-1 gp120 V1/V2亚单位疫苗的研究。

Cry1Ia和Cry2Ab融合蛋白的表达

[目的]苏云金芽孢杆菌表达的杀虫蛋白Cry1Ia和Cry2Ab对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为充分利用已有Cry蛋白,本文构建了两者的融合蛋白,并对融合蛋白的原核表达进行检测。[方法]本文将两个基因的编码基因,按照两种先后顺序拼接起来,获得cry1Ia-cry2Ab融合基因和cry2Ab-cry1Ia融合基因。另外,将Cry1Ia蛋白N端第一个α-螺旋(73个氨基酸)的编码序列删除后,接入cry2Ab基因5'端,获得第三个融合基因cry1IaD73-cry2Ab。将3个基因分别插入pHT304载体,并由cry1Ac基因的启动子和终止子调控其在Bt细胞中表达。[结果]SDS-PAGE结果显示,Cry1Ia-Cry2Ab、Cry2Ab-Cry1Ia和Cry1IaD73-Cry2Ab三个融合蛋白均能够在Bt细胞中表达,其测定分子量与预期大小一致,分别约152kDa、152kDa和144kDa。蛋白印迹法分析发现,在表达过程中,三种融合蛋白均有一定比例的降解。另外,不同温度对融合蛋白的表达也有不同程度的影响。[结论]本研究构建了3种融合杀虫基因并在Bt细胞中成功表达,为进一步解析这类融合蛋白的杀虫活性和机理奠定了基础。

共价连接β2m的HLA-A2/IgG1二聚体的构建、表达与纯化

目的HLA-A2/IgG1二聚体经蛋白A(SPA)亲合层析柱浓缩纯化时容易发生β2 m解离,为了解决这个问题,研究构建与表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白。方法利用基因重组技术构建β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-[β2 m-HLA-A2/IgG1],将其转染721.221细胞系,筛选高表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的细胞株;收集细胞培养上清,SPA亲合层析柱浓缩纯化,检测该蛋白的纯化效率。结果β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因转染721.221细胞后可表达正确构象的β2 m-HLA-A2/IgG1二聚体,Western blot显示β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的分子量与预期大小一致;经SPA亲合层析柱纯化后,β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白较HLA-A2/IgG1融合蛋白的纯化效率约高5倍。结论共价连接β2 m的HLA-A2二聚体有助于HLA-A2二聚体在低pH值的环境下保持构象完整。

蛋白激酶全抑制分析揭示KG-1细胞增殖的分子机制

目的:通过分析KG-1细胞对各种蛋白激酶抑制剂的反应,探讨其增殖的分子机制。方法:采用CCK-8法、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western-blot检测各种蛋白激酶抑制剂对KG-1细胞增殖、相关基因mRNA表达水平以及FGFR1下游信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:NVP-BGJ398和PD173074有效抑制KG-1细胞的增殖,表明FGFR及其下游信号通路在KG-1细胞增殖过程中具有关键作用。使用FGFR抑制剂处理后,p-FGFR1和p-STAT5水平显著下降(P<0.001),p-Akt水平稍有下降(P<0.05),并未影响p-ERK水平(P>0.05)。结论:FGFR1OP2-FGFR1主要作用于下游STAT5信号通路,以促进细胞增殖。蛋白激酶全抑制分析是一种可靠而直接的方法,可用于确定癌细胞增殖的分子机制。

动力蛋白相关蛋白1抑制剂对肠黏膜上皮细胞缺血再灌注损伤的干预作用及其机制

目的探讨动力蛋白相关蛋白1(Drp1)抑制剂对肠黏膜上皮细胞缺血再灌注损伤的干预作用并分析其机制。方法将人大肠黏膜上皮细胞系Caco-2分为对照组、模型组、Drp1抑制剂组,对照组正常培养细胞,模型组、Drp1抑制剂组均采用缺氧12 h后复氧2 h的方法构建缺氧复氧模型,Drp1抑制剂组在H/R前给予Drp1抑制剂Mdivi-1干预。采用CCK-8法检测细胞活力,线粒体超氧化物指示剂检测线粒体活性氧(ROS)含量,JC-1法检测线粒体膜电位,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting法检测细胞Drp1、线粒体融合蛋白2(Mfn2)蛋白。结果细胞活力对照组>Drp1抑制剂组>模型组(P均<0.05);细胞内线粒体ROS含量模型组>Drp1抑制剂组>对照组,线粒体膜电位对照组>Drp1抑制剂组>模型组(P均<0.05);细胞凋亡率模型组>Drp1抑制剂组>对照组(P均<0.05);细胞Drp1蛋白表达模型组>Drp1抑制剂组>对照组,Mfn2蛋白表达对照组>Drp1抑制剂组>模型组(P均<0.05)。结论Drp1抑制剂可减轻肠黏膜上皮细胞缺血再灌注损伤,其机制可能与改善线粒体功能障碍、减少细胞凋亡有关。

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因的克隆与表达

目的 构建融合基因pcDNA3 1/His B IL 2 G1,为进一步研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗奠定基础。方法采用PCR从含有人源IL 2的质粒中扩增出IL 2片段 ,将人源IL 2插入真核表达载体pcDNA3 1/His B中 ,构建的质粒命名为pcDNA3 1/His B IL 2。同样采用PCR扩增汉坦病毒H82 0 5株G1基因片段 ,将回收的G1片段经双酶切插入到pcD NA3 1/His B IL 2 ,构建成新的质粒pcDNA3 1/His B IL 2 G1。采用脂质体介导包裹 ,转入NIH3T3细胞中进行瞬时表达 ;采用原位杂交观察细胞内的基因表达 ,SDS PAGE法作重组质粒pcDNA3 1/His B IL 2 G1瞬时表达产物的鉴定。结果 融合基因可转录并表达一分子量为 78kD左右的蛋白 ,对照组则未见电泳条带出现。结论 成功构建pcDNA3 1/His B IL 2 G1融合基因 。

前体mRNA剪接蛋白Tra2β1的抗体制备及鉴定

Tra2 β1是Tra2 β前体mRNA剪接调节蛋白家族中的一个组织分布最广、表达量最多的成员 ,它在选择性前体mRNA剪接中有调节功能 ,而在基础性剪接中不是必需的 .为便于对该蛋白功能的进一步研究 ,需要制备能特异地检测Tra2 β1蛋白的抗体 .选择包含Tra2 β1的N端 12个氨基酸的特异编码序列的Tra2 β2全长编码序列 (共 117个核苷酸 ) ,将其克隆至pGEX 3X表达载体形成GST融合基因 ,并以诱导表达和纯化的该融合蛋白为抗原免疫新西兰兔 ,获得了相应的抗体 .Western印迹和免疫细胞化学分析结果显示 ,获得的抗体能特异地检测Tra2

应用斑点金免疫渗滤试验快速同步检测抗HIV-1,HIV-2IgG抗体

应用斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)建立了一种同步快速检测四种抗HIV-1/2IgG抗体的HIV诊断试纸。通过基因工程技术在大肠杆菌中表达了5种HIV抗原蛋白片段(P24,GP41,GP36,GP120V3,GP120C)。这5种抗原蛋白首先被固定在硝酸纤维素膜上,然后滴加待测血清,其中的病毒抗体通过免疫反应与抗原结合,再加胶体金标记的葡萄球菌蛋白A(SPA),待其渗过膜片后,洗涤,即可形成肉眼可见的红色斑点。用已确证的21份HIV阳性血清(其中包括1份HIV-1标准阳性血清和1份HIV-2标准阳性血清)和30份阴性血清进行了试验,结果表明该快速检测方法与ELISA方法无显著差异。该检测方法不需任何仪器,仅凭肉眼即可判定结果,整个检测过程不超过5分钟。与传统的的ELISA法相比,具有方便快速,成本低廉,应用范围广等优点。同时,此HIV快速诊断试纸可以同步检测并区分针对HIV-1和HIV-2感染的不同检测标志物(抗P24、GP41、GP120和GP36抗体),这对提高快速检测的灵敏度和准确性,以及对判断HIV感染者是否临近或已进入AIDS期有着较高的应用价值。