人类新型β3半乳糖基转移酶基因β3GalT7的克隆和鉴定

从人肺cDNA文库中克隆到人类β3-半乳糖基转移酶家族中的一个新成员β3GalT7(AY277592,EC2.4.1.-),并对其进行了鉴定. 该基因定位在人类染色体19q13.2. 它包含一个1 191 bp的开放阅读框(ORF). 编码的蛋白质包括一个信号肽和一个半乳糖基转移酶结构域,分子质量和等电点分别为43.3 ku和8.37. 从原核表达中获得的融合蛋白的分子质量和预测相符. RNA印迹杂交显示β3GalT7在肺、喉和回肠组织中高表达,而在舌、乳房、子宫、睾丸等组织中表达较低. 此外半定量RT-PCR显示β3GalT7在人类不同的肿瘤细胞中转录水平有明显差异.

糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在多种肿瘤细胞中的表达

目的:探讨一种新的糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在多种肿瘤细胞中的mRNA表达情况。方法:运用半定量RT-PCR方法研究人β3GnT8/β3GalT7基因在11种恶性肿瘤细胞中的表达谱。结果:β3GnT8/β3GalT7基因在多种肿瘤细胞株中都有表达,在A549细胞中的表达最高,在SGC7901细胞中中度表达,在白血病细胞中的表达较低。结论:β3GnT8/β3GalT7基因在11种肿瘤细胞中的表达有显著差异。

人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中的表达差异及其原核表达和鉴定

目的研究一种新的人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中mRNA水平的表达情况,并在原核体系中克隆和表达。方法运用半定量RT-PCR方法研究人β3GnT8/β3GalT7在13种恶性血液系统肿瘤细胞中的表达谱,以其中表达该基因最高的THP-1细胞的cDNA为模板,克隆目的基因,构建重组表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。经超声裂菌,尿素溶解包涵体,过Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化,透析复性浓缩后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot验证。结果 K562、U937、THP-1和NB4细胞株均较高效表达β3GnT8/β3GalT7,其中THP-1细胞株表达最高;并成功构建原核表达载体pQE30-β3GnT8/β3GalT7,表达出相应的重组蛋白。结论人β3GnT8/β3GalT7在13株细胞中表达有显著差异,并获得大量较纯的目的蛋白,其分子量与预测相符,为单克隆抗体制备及进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。

人类β3GnT8/β3GalT7对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用

目的探讨人类β1,3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶8/β3半乳糖基转移酶7(β3GnT8/β3GalT7)与人4IgB7-H3蛋白的相互作用,以期阐明该糖基转移酶对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用。方法在线预测软件预测人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的糖基转移酶作用位点;免疫共沉淀探讨β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白的相互结合作用;细胞免疫荧光化学技术研究两种蛋白质在细胞内的空间定位。结果人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的N-糖基化位点共有8个,O-β-GlcNAc的附着位置共有18个;β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白能相互结合而被共沉淀;两种蛋白质能在人肺癌A549细胞中共定位。结论人类β3GnT8/β3GalT7可能对人4IgB7-H3蛋白有糖基化修饰作用。

反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7表达的调节作用

目的:研究反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7(β3GalT7)表达的调节,以期阐明caveolin-1与β3GalT7的相关性。方法:运用脂质体介导转染人工合成的caveolin-1反义核苷酸(ASODN)至人类4种实质肿瘤细胞中,通过荧光显微镜、RT-PCR及蛋白质印迹检测β3GalT7表达的变化。结果:转染反义caveolin-1后的4种实质肿瘤细胞中β3GalT7均有明显的增强。结论:表明caveolin-1调节肿瘤细胞中β3GalT7的表达,且与β3GalT7的表达呈负相关。

β3GnT8基因对HL60细胞体外侵袭能力的影响

目的：初步探讨β3GnT8/GalT7基因对HL60细胞体外侵袭的作用。方法通过脂质体介导将实验室构建好的β3GnT8真核正义表达载体pEGFP-C1-T8-Sense和反义表达载体pEGFP-C1-T8-AntiSense转染入HL60细胞；RT-PCR和Western blot检测浸润转移相关的功能基因TGFβ1、MMP2、MMP14在mRNA水平和蛋白质水平的表达变化；Transwell侵袭实验检测β3GnT8对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果随着β3GnT8表达上调，细胞侵袭能力高于对照组（P＜0.05），MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达上调，而TGFβ1表达下调；随着β3GnT8表达下调，细胞侵袭能力下降，MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达下调，而TGFβ1表达上调。结论β3GnT8可在体外增强HL60细胞的侵袭能力，而该作用可能源于它能够诱导肿瘤侵袭相关蛋白的表达变化。

人类β3-N-乙酰氨基葡萄糖基(β3半乳糖)转移酶β3GnT8/GalT7的抗体制备、免疫组化分析及其亚细胞定位

目的探讨β3GnT8(β3GalT7,AY277592,EC2.4.1.-)基因(人类β3-糖基转移酶家族中的一个新成员)的功能。方法原核表达该蛋白,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗血清;以Westernblot和免疫组化分析其在多种组织细胞的表达情况;并通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位。结果获得了较纯的表达蛋白和高效价、高特异性的抗血清,并且发现该蛋白大部分位于核膜周围的胞浆中;免疫组化分析显示肿瘤细胞和组织中该酶有较高的表达,与正常组织比较具有一定的差异性。结论该实验获得了β3GnT8/β3GalT7基因的蛋白质和相应抗体,并且对该蛋白进行了亚细胞定位,为对其生物学功能的进一步研究奠定了基础。