为研究TGF-β通路对猪颗粒细胞增殖、凋亡的影响,本研究对TGF-β通路基因进行调控处理,设计并筛选可高效干扰TGFβRⅠ及TGFβRⅡ表达的载体,转染不同干扰载体及添加10 ng/m L TGFβ1和25 ng/m L FSH,采用Westernblot、MTT和流式细胞法...为研究TGF-β通路对猪颗粒细胞增殖、凋亡的影响,本研究对TGF-β通路基因进行调控处理,设计并筛选可高效干扰TGFβRⅠ及TGFβRⅡ表达的载体,转染不同干扰载体及添加10 ng/m L TGFβ1和25 ng/m L FSH,采用Westernblot、MTT和流式细胞法检测不同处理对颗粒细胞TGFβ RI和TGFβ RII蛋白表达量和细胞增殖凋亡的影响。结果表明:成功筛选出干扰效率最高的p OSP1-TGFβRⅠ-sh5和p OSP1-TGFβRⅡ-sh3载体,对TGFβRⅠ和TGFβRⅡ的抑制率分别为78.00%和84.10%;转染后TGFβRⅠ干扰组的TGFβRⅠ蛋白表达量显著低于其阴性对照组;TGFβRⅡ干扰组、TGFβ1组和FSH组的TGFβRⅡ蛋白表达量显著低于其阴性对照组;TGFβ RI干扰组、TGFβ RII干扰组的增殖抑制率极显著高于PLL3.7空载体组,TGFβ 1组细胞增殖抑制率极显著高于空白对照组且FSH组的增殖抑制率显著高于空白对照组;TGFβRⅠ干扰组和TGFβRⅡ干扰组细胞凋亡率极显著高于PLL3.7空载体组;TGFβ1组和FSH组细胞凋亡率极显著高于空白对照组。总之,RNAi介导的TGFβRⅠ和TGFβRⅡ沉默和外源因子(10 ng/m L TGFβ1和25 ng/m L FSH)引起的TGFβRⅡ蛋白下调,均会减弱TGF-β信号传导通路对卵泡颗粒细胞的促进作用,进而抑制卵泡颗粒细胞的增殖,促进其凋亡。展开更多
目的:构建敲除TGF-βRⅡ的靶向CLDN18.2的CAR T细胞,并探索其在胃食管交界癌中的治疗潜力;方法:通过CRISPR/Cas9敲除T细胞中的TGF-βRⅡ,并使用慢病毒感染法构建CLDN18.2 CAR T细胞;流式细胞术检测CAR T细胞的阳性率、食管腺癌细胞系中C...目的:构建敲除TGF-βRⅡ的靶向CLDN18.2的CAR T细胞,并探索其在胃食管交界癌中的治疗潜力;方法:通过CRISPR/Cas9敲除T细胞中的TGF-βRⅡ,并使用慢病毒感染法构建CLDN18.2 CAR T细胞;流式细胞术检测CAR T细胞的阳性率、食管腺癌细胞系中CLDN18.2的表达情况、CAR T细胞中Smad2/3的磷酸化水平以及PD-1的表达水平;免疫荧光法检测CAR T细胞中TGF-βRⅡ的表达;LDH释放实验检测对靶细胞的细胞毒性;裸鼠移植瘤模型检测肿瘤抑制能力;ELISA实验检测肿瘤组织中细胞因子的释放水平;结果:成功构建敲除TGF-βRⅡ的CLDN18.2 CAR T细胞(18.2BBZ/TGFBRKO)以及二代CLDN18.2 CAR T细胞(CLDN18.2);18.2BBZ及18.2BBZ/TGFBRKO在体外对CLDN18.2+的肿瘤细胞具有剂量依赖型细胞毒性;TGF-β1不能使18.2BBZ/TGFBRKO的Smad2/3发生磷酸化,在TGF-β1存在时,18.2BBZ/TGFBRKO与肿瘤细胞共孵育后PD-1的表达水平显著低于18.2BBZ(P<0.001);18.2BBZ/TGFBRKO较18.2BBZ对裸鼠移植瘤的抑制能力更强(P<0.0001),并且在肿瘤组织中保持更强的细胞因子分泌水平(P<0.01);结论:通过CRISPR/Cas9敲除CLDN18.2 CAR T细胞中的TGF-βRⅡ可以有效降低T细胞耗竭,并在小鼠移植瘤模型中产生更强的抑制肿瘤活性,并增加促炎性细胞因子的分泌。展开更多
文摘为研究TGF-β通路对猪颗粒细胞增殖、凋亡的影响,本研究对TGF-β通路基因进行调控处理,设计并筛选可高效干扰TGFβRⅠ及TGFβRⅡ表达的载体,转染不同干扰载体及添加10 ng/m L TGFβ1和25 ng/m L FSH,采用Westernblot、MTT和流式细胞法检测不同处理对颗粒细胞TGFβ RI和TGFβ RII蛋白表达量和细胞增殖凋亡的影响。结果表明:成功筛选出干扰效率最高的p OSP1-TGFβRⅠ-sh5和p OSP1-TGFβRⅡ-sh3载体,对TGFβRⅠ和TGFβRⅡ的抑制率分别为78.00%和84.10%;转染后TGFβRⅠ干扰组的TGFβRⅠ蛋白表达量显著低于其阴性对照组;TGFβRⅡ干扰组、TGFβ1组和FSH组的TGFβRⅡ蛋白表达量显著低于其阴性对照组;TGFβ RI干扰组、TGFβ RII干扰组的增殖抑制率极显著高于PLL3.7空载体组,TGFβ 1组细胞增殖抑制率极显著高于空白对照组且FSH组的增殖抑制率显著高于空白对照组;TGFβRⅠ干扰组和TGFβRⅡ干扰组细胞凋亡率极显著高于PLL3.7空载体组;TGFβ1组和FSH组细胞凋亡率极显著高于空白对照组。总之,RNAi介导的TGFβRⅠ和TGFβRⅡ沉默和外源因子(10 ng/m L TGFβ1和25 ng/m L FSH)引起的TGFβRⅡ蛋白下调,均会减弱TGF-β信号传导通路对卵泡颗粒细胞的促进作用,进而抑制卵泡颗粒细胞的增殖,促进其凋亡。
文摘目的:构建敲除TGF-βRⅡ的靶向CLDN18.2的CAR T细胞,并探索其在胃食管交界癌中的治疗潜力;方法:通过CRISPR/Cas9敲除T细胞中的TGF-βRⅡ,并使用慢病毒感染法构建CLDN18.2 CAR T细胞;流式细胞术检测CAR T细胞的阳性率、食管腺癌细胞系中CLDN18.2的表达情况、CAR T细胞中Smad2/3的磷酸化水平以及PD-1的表达水平;免疫荧光法检测CAR T细胞中TGF-βRⅡ的表达;LDH释放实验检测对靶细胞的细胞毒性;裸鼠移植瘤模型检测肿瘤抑制能力;ELISA实验检测肿瘤组织中细胞因子的释放水平;结果:成功构建敲除TGF-βRⅡ的CLDN18.2 CAR T细胞(18.2BBZ/TGFBRKO)以及二代CLDN18.2 CAR T细胞(CLDN18.2);18.2BBZ及18.2BBZ/TGFBRKO在体外对CLDN18.2+的肿瘤细胞具有剂量依赖型细胞毒性;TGF-β1不能使18.2BBZ/TGFBRKO的Smad2/3发生磷酸化,在TGF-β1存在时,18.2BBZ/TGFBRKO与肿瘤细胞共孵育后PD-1的表达水平显著低于18.2BBZ(P<0.001);18.2BBZ/TGFBRKO较18.2BBZ对裸鼠移植瘤的抑制能力更强(P<0.0001),并且在肿瘤组织中保持更强的细胞因子分泌水平(P<0.01);结论:通过CRISPR/Cas9敲除CLDN18.2 CAR T细胞中的TGF-βRⅡ可以有效降低T细胞耗竭,并在小鼠移植瘤模型中产生更强的抑制肿瘤活性,并增加促炎性细胞因子的分泌。