γ干扰素诱导蛋白30基因在系统性红斑狼疮CD4^+T细胞中的表达分析

目的探讨系统性红斑狼疮(system ic lupus erythem atosus,SLE)患者CD4+T细胞mRNA中干扰素诱导蛋白30基因(IP-30)的表达水平与SLE疾病活动度的相关性。方法收集23例SLE患者和10例正常对照人群的临床资料。取外周血用免疫磁珠法分离出CD4+T细胞,抽提RNA并逆转录合成cDNA,运用GLG I方法从LongSAGE标签库中筛选出IP-30,比较该基因在系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI)不同的SLE患者中表达的差异。结果①SLE患者组IP-30的表达量显著高于正常对照(P=0.01,P<0.05)。SLEDAI≥10组和SLEDAI<10组其IP-30的表达量显著高于正常对照(P分别为0.01和0.047),但两组间比较无显著差别(P=0.149)。②SLE有狼疮肾炎组和SLE无狼疮肾炎组相比IP-30表达量有差异(P<0.05)。③IP-30的表达量随SLE的活动水平升高而明显增加,与SLEDAI具有显著的正相关(r=0.830,P<0.01),与补体C3和外周血白细胞数成负相关(r=-0.517,r=-0.424,P<0.05)。结论CD4+T细胞IP-30水平表达升高提示IP-30可能参与SLE的发病,并对SLE活动度的判断和狼疮肾炎的诊断有一定的意义。

敲低IFI30通过激活STAT1抑制U251人胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移并促进其凋亡

目的 构建γ干扰素诱导蛋白30(IFI30)表达抑制的U251细胞,探讨IFI30表达受到抑制后对细胞生物学功能的影响及机制。方法 在线设计敲低靶点并合成3条小干扰RNA(siRNA),转染后通过实时定量PCR技术检测抑制效率,选取抑制效率最高的siRNA序列构建短发夹RNA (shRNA)质粒。重组质粒与包装质粒共转染HEK293T细胞制备慢病毒。用慢病毒感染胶质瘤U251细胞,经嘌呤霉素筛选得到阳性细胞。采用CCK-8实验、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)实验和集落形成实验分析细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,Transwell^(TM)实验检测细胞侵袭、划痕实验检测细胞迁移。Western blot法检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和神经钙黏蛋白(N-cadherin)、信号转导子与转录激活子1(STAT1)。结果 筛选到有效的靶点序列并成功建立IFI30表达抑制的U251细胞。敲低IFI30的表达抑制U251细胞增殖,G0/G1期细胞比例增加,S期减少,细胞凋亡明显增加,细胞的侵袭和迁移能力降低。同时,U251细胞cyclin D1、Bcl2和N-cadherin的表达降低,E-cadherin, STAT1磷酸化表达增加。结论 敲低IFI30通过促进STAT1活化抑制U251细胞增殖、侵袭和迁移并促进其凋亡。

融合蛋白SMP30-IP10真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞迁移、侵袭、增殖的影响

目的构建融合蛋白SMP30-IP10真核表达质粒,并初步探究其对肝癌细胞株SK-hep1迁移、侵袭及增殖的影响。方法将肝癌细胞株SK-hep1分为两组,实验组转染p IRES-SMP30-IP10质粒,对照组转染空质粒p IRES;通过重叠PCR方法构建p IRES-SMP30-IP10真核表达质粒;采用脂质体转染法转染肝癌细胞SK-hep1;Western blotting法检测蛋白表达;Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力;CCK8法检测细胞增殖能力。结果通过PCR、双酶切及测序鉴定证实成功构建了真核表达质粒p IRES-SMP30-IP10,并在肝癌细胞株SK-hep1中正确表达。与对照组相比,实验组细胞迁移、侵袭能力下降(P均<0.05),但细胞形态及增殖能力均差异无统计学意义(P均>0.05)。结论成功构建了融合蛋白SMP30-IP10真核表达质粒,融合蛋白SMP30-IP10可抑制肝癌细胞的迁移、侵袭能力,但对细胞的增殖能力影响不明显。

猪干扰素γ诱导蛋白30基因表达载体的构建及验证

干扰素γ诱导蛋白30基因(IFI30)能够在特异抗原递呈细胞中组成性表达,在其他细胞中能被IFN-γ诱导表达,IFI30在MHC-Ⅱ限制性抗原加工递呈过程中起关键性作用。为了构建猪IFI30表达载体并验证其在体外细胞表达情况。本试验从猪肺脏组织中扩增出IFI30中长度741bp的CDS区,将其克隆到带有红色荧光的真核表达pEF1a-IRES-DsRed-Express2上,用脂质体转染法转染到Marc145细胞中,用RT-PCR以及Western blot检测其mRNA表达量和蛋白表达量。结果表明,成功构建出猪IFI30表达载体并在Marc145细胞中高效表达。

IFI 30、PD-L1在人脑胶质瘤中的表达及与病人预后的关系

目的探讨γ干扰素诱导蛋白30(IFI 30)、程序性死亡因子配体1(PD-L1)在人脑胶质瘤中的表达及与病人预后的关系。方法选择2015年5月~2019年5月手术切除的103例人脑胶质瘤组织和瘤旁组织,采用免疫组织化学染色检测IFI 30、PDL1表达情况。随访24个月,记录无进展生存期和总生存期。结果胶质瘤组织IFI 30、PD-L1高表达率[分别为70.87%(73/103)、68.93%(71/103)]明显高于瘤旁组织[分别为19.42%(20/103)、21.36%(22/103);P<0.001]。胶质瘤组织IFI 30表达水平与PD-L1表达水平呈明显正相关(r=0.583,P<0.05)。随访24个月,生存75例,死亡28例;多因素logistic回归分析显示,IFI 30高表达、PD-L1高表达是增加病人死亡风险的独立危险因素(P<0.05)。生存曲线分析显示,IFI 30高表达组2年累积生存率(64.52%)和2年累积无进展生存率(65.56%)均明显低于低表达组(分别为82.25%、89.45%;P<0.05)。PD-L1高表达组2年累积生存率(61.78%)和2年累积无进展生存率(60.14%)均明显低于低表达组(分别为88.52%、79.86%;P<0.05)。结论人脑胶质瘤组织IFI30、PD-L1呈高表达,与病人不良预后密切相关。

IFI30调控NF-κB信号通路对胶质母细胞瘤细胞增殖和迁移侵袭的影响

目的 探讨干扰素γ诱导蛋白30(IFI30)对胶质母细胞瘤(GBM)细胞增殖和迁移侵袭的影响及其分子机制。方法 利用GEPIA网站分析GBM组织的IFI30水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测GBM细胞的IFI30水平。采用脂质体法向U251细胞转染靶向IFI30的小干扰RNA序列(IFI30 siRNA组)或无义序列(NC组),另采用核因子(NF)-κΒ激活剂1(Act1)处理IFI30-siRNA转染的细胞(IFI30 siRNA+Act1组),qPCR和Western blotting检测IFI30以及NF-κB p50亚基和抑制蛋白-α(IκB-α)的磷酸化。结果 IFI30在GBM组织表达上调(P<0.05),且IFI30高表达GBM患者的总生存期短于IFI30低表达患者(P<0.05)。N299、U87、A172和U251细胞的IFI30的相对表达水平高于NHA细胞(P<0.05)。相较于NC组,IFI30 siRNA组U251细胞的IkBα磷酸化水平升高,而p50磷酸化表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);相较于IFI30 siRNA组,IFI30 siRNA+Act1组U251细胞的IkBα磷酸化水平降低,而p50的磷酸化水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。IFI30 siRNA组较NC组的U251细胞增殖活力减弱,侵袭数量和划痕愈合率减少,而IFI30 siRNA+Act1组较IFI30 siRNA组的U251细胞增殖活力增强,侵袭数量和划痕愈合率增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IFI30通过激活NF-κB信号通路在GBM中发挥致癌作用,显示其作为GBM潜在治疗靶点的可能性。

转染干扰素-γ诱导蛋白-10基因构建树突状细胞前列腺癌瘤苗及其抗肿瘤免疫作用的检测

目的 将小鼠前列腺癌细胞株RM-1裂解产物加载树突状细胞(DC)后,转染干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10)基因构建DC瘤苗,探讨该瘤苗对小鼠抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法将RM-1细胞的裂解产物作为肿瘤抗原加载小鼠骨髓来源的DC,并通过脂质体法转染IP-10基因,构建DC瘤苗;检测DC瘤苗的抗前列腺癌免疫治疗作用和免疫保护作用。结果 转染DC强表达IP-10,其上清对淋巴细胞有较强的趋化作用;构建的DC瘤苗能诱导特异性抗前列腺癌免疫反应,经瘤苗处理的荷瘤小鼠瘤体生长减慢,存活期延长;瘤苗还具有明显的免疫保护作用。结论构建的前列腺癌DC瘤苗在体内能有效诱导抗肿瘤免疫反应和免疫保护功能。

维甲酸诱导基因G抑制肿瘤细胞增殖的分子机制研究

目的探讨维甲酸诱导基因G（RIG—G）抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。方法应用转染实验、Western印迹法、免疫共沉淀和免疫荧光共定位等技术验证RIG—G蛋白与JAB1蛋白之间的相互作用，并研究RIG—G蛋白对JAB1蛋白功能的影响。结果RIG—G蛋白可以与JAB1蛋白发生相互作用，并影响JAB1蛋白在细胞内的定位和分布。实验发现，在NIH3T3细胞中单独转染JAB1时，JAB1蛋白在细胞核和细胞质内呈弥散分布，而当与RIG—G共同转染后，JAB1蛋白在细胞核内的含量明显减少，而改变为主要在胞质内分布，并与RIG—G蛋白发生部分共定位。此外，RIG—G蛋白还具有抑制JAB1对细胞周期抑制因子p27的辅助降解功能。结论RIG—G可以通过和JAB1的相互作用，使后者部分滞留在细胞质内，从而影响JAB1发挥正常功能，干扰其对p27的辅助降解，维持细胞内p27的稳定性，促进细胞退出增殖周期，抑制细胞增殖。